材料和试剂

移液器提示（Greiner Bio One International，Ultratip）
管50毫升（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
注射器10 ml（B.Barun medical，目录号：4606108V-02）
针26 G x½“（B. Braun医疗，目录号：4665457-02）
预分离过滤器（30μm）（Miltenyi Biotec，目录号：130-041-407）
Millicell EZ Slide 8孔玻璃（EMD Millipore，目录号：PEZGS0816）
96孔，黑色，平底板，无菌，带盖（Corning，目录号：3916）
C57BL / 6J小鼠，优选年龄在8-12周龄，男性和女性均适合本方案（“JACKSON LABORATORY”，目录号：000664）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190144）}
0.5M EDTA，无菌（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15575020）}
Histopaque-1077（Sigma-Aldrich，目录号：10771）
Histopaque-1119（Sigma-Aldrich，目录号：11191）
可选择性：FITC缀合的小鼠抗人CD15抗体（克隆VIMC6）（Miltenyi Biotec，目录号：130-081-101）
可选：FITC偶联小鼠IgM同种型对照（Miltenyi Biotec，目录号：130-093-178）
可选：MACSxpress嗜中性粒细胞分离试剂盒，人（Miltenyi Biotec，目录号：130-104-434）
可选：MACSxpress红细胞消耗试剂盒，人（Miltenyi Biotec，目录号：130-098-196）
小鼠嗜中性粒细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号：130-097-658）
可选：碘化丙啶（PI）染色溶液（BD，BD Biosciences，目录号：556463）
佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P8139）
注意：溶解在DMSO中以制备1毫克/毫升的储备液，并将等分试样储存在-20℃。
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
16％（w / v）多聚甲醛（PFA），无甲醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：28908）
纯化的小鼠抗DNA /组蛋白H1抗体（EMD Millipore，目录号：MAB3864）
注意：将等分试样储存在-20°C。
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐（DAPI）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：D1306）}
Alexa Fluor 555缀合的山羊抗小鼠IgG二抗（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：A-21422）}
可选：APC结合的大鼠抗小鼠Ly6G（Gr-1）抗体（克隆RB6-8C5）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience ^{TM，目录号：17-5931-82）}
可选择性：APC结合的大鼠IgG2b同种型对照（克隆eB149 / 10H5）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience ^{TM，目录号：17-4031-82）}
可选：纯化的大鼠抗小鼠Ly6G抗体（克隆RB6-8C5）（Abcam，目录号：ab25377）
可选：纯化的兔抗人CD15抗体（克隆SP159）（Novus Biologicals，目录号：NBP2-21754）
纯化的山羊抗人/小鼠髓过氧化物酶/ MPO抗体（R＆amp; D Systems，目录号：AF3667）
纯化的小鼠IgG2a同种型对照（克隆C1.18.4）（BD，BD Biosciences，目录号：550339）
纯化兔抗人/小鼠嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗体（Abcam，目录号：ab68672）
Sytox orange核酸染色（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：S11368）}
胎牛血清（FBS）（Biochrom，目录号：S 0615）
叠氮化钠（NaN 3 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
RPMI 1640培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：21875034）}
GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific，目录号：35050038）
MEM非必需氨基酸（NEAA）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11140035）}
青霉素/链霉素（Biochrom，目录号：A 2213）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
山羊血清（Sigma-Aldrich，目录号：G9023）
荧光安装介质（Agilent Technologies，DAKO，目录号：S302380-2）
FACS缓冲液（可在4℃保存2周）（参见配方1）
R1培养基（制备的培养基可以在4℃保存2周）（参见方法2）
阻塞缓冲液（准备新鲜）（参见配方3）
抗体稀释液（准备新鲜）（参见配方4）

设备

移液器
离心机
可选：MACSxpress分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-098-308）
可选：MACSmix ^{TM管旋转器（Miltenyi Biotec，目录号：130-090-753）}
加湿细胞培养箱设定为37℃和5％CO 2
轨道摇床，如Heidolph Unimax 1010（Heidolph Instruments，型号：Unimax 1010，目录号：543-12310-00）
荧光显微镜，如蔡司Axiophot显微镜与AxioCam数字彩色相机和AxioVision软件v4.7（卡尔蔡司，型号：Axiophot）
AxioCam数码彩色相机
可测量分别为547nm和570nm的Sytox橙的吸光度和发射率的微孔板读数器，如Mithras LB940（BERTHOLD TECHNOLOGIES，型号：Mithras LB 940）
可选：流式细胞仪（检查分离的嗜中性粒细胞的纯度）FACS Canto II（BD，BD Biosciences，型号：BD FACSCANTO II）与FACSDiva软件

软件

AxioVision软件
可选：FACSDiva软件

程序

嗜中性粒细胞分离
1. 使用梯度离心法从新鲜的外周血中分离人嗜中性粒细胞（图1A和1B）
  1. 用含有2mM EDTA的PBS稀释外周血1：2。
  2. 在每个50ml管中，仔细并顺序地放置10ml Histopaque-1119,10ml Histopaque-1077和25ml稀释的血液。
    注意：Histopaque在使用前应该达到室温。
  3. 在室温下离心30分钟，在700℃离心（注意：不断裂。）。
  4. 将Histopaque-1077和Histopaque-1119的界面上的层转移到新的50ml管（通常的体积范围为2-3ml）中，用PBS加至50ml，并以300xg离心>室温10分钟。
  5. 用30 ml PBS再次洗涤。
    注意：来自健康供体的每ml外周血的嗜中性粒细胞的平均产量预计为2-5百万个细胞。
    
    图1.中性粒细胞分离。 A.通过梯度离心从健康供体的新鲜外周血中分离人嗜中性粒细胞（步骤A1）。收集H1077和H1119界面处的嗜中性粒细胞层。 PBMC，外周血单核细胞; PMN，多形核白细胞;红细胞，红细胞。 B.用PI染料分析细胞活力，并使用PI阴性门内的人CD15抗体分析活嗜中性粒细胞的纯度。 C.用MACSxpress法从血沉棕黄层中分离人嗜中性粒细胞（步骤A2）。用PI染料分析细胞活力，并用PI阴性门内的人CD15抗体分析活细胞嗜中性粒细胞的纯度。 D.使用负耗尽方法通过磁选分离小鼠骨髓嗜中性粒细胞（步骤A3）。用PI染料分析细胞活力，用PI阴性门内的小鼠Ly6G（Gr-1）抗体分析活细胞嗜中性粒细胞的纯度。灰色直方图：PI染料或CD15抗体或Gr-1抗体;开放直方图：未染色的对照或同种型抗体
2. 替代方法：用MACSxpress嗜中性粒细胞分离试剂盒分离人嗜中性粒细胞（图1C）
  1. 混合5ml的血沉棕黄层（注意：收集后不到12小时。）与1ml重组缓冲液A（试剂盒组分），1ml缓冲液B和100μl重构的MACSxpress红细胞消耗试剂混合。
  2. 使用MACSmix管旋转器以12rpm在室温下孵育样品5分钟。
  3. 将开管放在MACSxpress分离器的磁场中10分钟，然后小心地收集含有嗜中性粒细胞的上清液到新管中。
3. 鼠骨髓嗜中性粒细胞的分离（图1D）
  1. 解剖C57BL / 6J小鼠的股骨，并通过使用10ml注射器和26G针无菌冲洗出含有2mM EDTA的10ml PBS的骨髓。
  2. 用30微米的过滤器过滤悬浮液。
  3. 按照制造商的说明，用小鼠嗜中性粒细胞分离试剂盒（Miltenyi），使用负耗竭方法通过免疫磁性分离（MACS）分离嗜中性粒细胞。
    注意：8-12周龄的一名C57BL / 6J小鼠的两只股骨骨髓中性粒细胞的平均产量预计为10-15万个细胞。
4. 可选：检查分离的嗜中性粒细胞的纯度和活力
  1. 在含有5μl抗人CD15-FITC抗体（或小鼠嗜中性粒细胞的抗小鼠Gr1-APC抗体）的100μlFACS缓冲液（参见方案1）中重悬2×10 5个分离的人嗜中性粒细胞。另外在含有5μl小鼠IgM-FITC同种型对照（或小鼠嗜中性粒细胞的大鼠IgG2b-APC同种型对照）的100μlFACS缓冲液中的另外2×10 5个细胞。在室温下在黑暗中孵育30分钟。
  2. 加入100μlFACS缓冲液，轻轻混合，离心，在室温下用3,000 RPM（870 x g，87 mm转子）的台式离心机收集细胞沉淀，除去上清液。
  3. 将沉淀重悬于300μlFACS缓冲液中，加入3μl碘化丙啶（PI）染色溶液，快速混匀
  4. 继续流式细胞仪分析CD15 ^{+ PI ^{- 细胞（人）或Gr-1 PI ^{- 细胞（小鼠）。}}}
NET免疫染色显示
注意：如果目的是研究特定贴壁细胞与嗜中性粒细胞和NET形成的相互作用，则将嗜中性粒细胞分离前一天将感兴趣的细胞种植到8孔玻璃室载玻片（Millicell EZ Slide 8-well glass）在每孔300μl培养基中培养过夜。接种细胞数目取决于靶细胞与嗜中性粒细胞的比例。为每个条件重复井。在添加嗜中性粒细胞前取出培养基
1. 诱导NET形成
  1. 将新鲜分离的嗜中性粒细胞加入到8孔玻璃室载玻片中，密度为2×10 5个嗜中性粒细胞，每孔在300μlR1培养基（参见方案2）中。为每个条件重复井。
    注意：将中性粒细胞重悬于R1培养基中6.67×10 5细胞/ ml，然后加入每孔300μl。
  2. 添加感兴趣的治疗方法（例如，潜在的化学活化剂/ NET抑制剂，细菌，相互作用细胞，等等）。
    注意：孵化时间需要单独优化，更多细节请参见注释1.
  3. 将PMA溶解在DMSO中以制备1mg / ml储备溶液。对于阳性对照孔和需要形成NET的条件，加入终浓度为100ng / ml的PMA以激活嗜中性粒细胞（即，在R1培养基中稀释PMA原液1：100，然后加入3μl稀释的PMA到每个孔）。（见注2）
  4. 在R1培养基中稀释DMSO 1：100，向阴性对照（静息嗜中性粒细胞）孔的每个孔中加入3μl稀释的DMSO。
  5. 在37℃培养箱中孵育3小时。
  6. 向每个孔中加入100μl4％PFA，而不用去除培养基（即终浓度为1％）即可将细胞固定在4℃过夜。
2. 第二天用抗DNA /组蛋白H1抗体和DAPI染色（图2A和2B）
  
  图2.通过免疫染色的NET证明。 2×10 人嗜中性粒细胞（A）或鼠嗜中性粒细胞（B）在孔中被100ng / ml PMA激活3小时的玻璃室幻灯片。休息的嗜中性粒细胞与DMSO作为阴性对照。固定滑动片并用抗DNA /组蛋白H1抗体标记，然后用AF555缀合的抗小鼠IgG（红色）标记，并用DAPI（蓝色）复染细胞核（步骤B1和B2）。 C.人类嗜中性粒细胞标志物CD15（绿色）和NET标记DNA /组蛋白H1（红色）在人类血管炎患者石蜡包埋的皮肤切片上的免疫染色。 D.在具有诱导的免疫复合物介导的血管炎的小鼠的石蜡包埋的皮肤切片上免疫染色小鼠嗜中性粒细胞标记Ly6G（绿色）和NET标记DNA /组蛋白H1（红色）（步骤B3）。比例尺=100μm。
  1. 取出培养基，每孔加入100μlPBS，然后取出
  2. 向每个孔中加入100μl封闭缓冲液（见配方3）。将载玻片在室温下静置45分钟。
  3. 在抗体稀释液中稀释DNA /组蛋白H1抗体（见方案4），终浓度为4μg/ ml。
  4. 向每个孔中加入100μl稀释的抗体，在室温下放置1 h
  5. 去除抗体，每个孔用100μlPBS洗涤载玻片两次，每次在轨道摇床上以100RPM冲洗5分钟。
  6. 稀释次级抗小鼠AF555 1：200抗体稀释液
  7. 向每个孔中加入100μl稀释的二抗，在室温下在黑暗中孵育45分钟。
  8. 去除抗体，用100μlPBS洗涤2次，在轨道摇床上
  9. 稀释DAPI 5mg / ml储备液在PBS中1：5,000，向每个孔中加入100μl，在室温下在黑暗中孵育3分钟。
  10. 取出DAPI染色溶液，取出腔室载玻片的框架。用PBS浸泡在容器中2次清洗。
  11. 用荧光安装介质安装盖子。
  12. 具有红色通道的荧光显微镜（AF555）和蓝色通道（DAPI）（例如，具有AxioCam数字彩色照相机和AxioVision软件的Zeiss Axiophot显微镜）（参见注3）。
3. 可选：用额外的嗜中性粒细胞标记染色（图2C和2D）
  额外的嗜中性粒细胞标记可以与NET共染色，以提供额外的构象。已经测试了以下一抗体，并且可以根据荧光显微镜上可得到的滤色剂数目考虑一种或多种组合：CD15（人，Novus，1:50），Ly6G（小鼠，Abcam，1:100），MPO（人和鼠，R＆amp; D Systems，1:50）或NE（人和小鼠，Abcam，1:200）。除了NET染色之外，具有不同荧光团的适当的二次抗体是必需的。该染色可以在NET染色之前进行。建议基于染色特异性和强度进行连续染色。
NET定量与Sytox橙（图3）
注意：如果目的是研究特异性贴壁细胞与嗜中性粒细胞和NET形成的相互作用，则将嗜中性粒细胞分离前一天将感兴趣的细胞种上96孔，黑色，平底板，每孔100μl好，文化一夜之间。接种细胞数目取决于靶细胞与嗜中性粒细胞的比例。为每个条件做5个重复的井。在添加嗜中性粒细胞之前，取出培养基。

图3. 1 x 10 ^{5 人类嗜中性粒细胞（hNeu）单独或与脂肪组织来源的间充质干细胞（MSC）在hNeu：MSC比例为1,000:1,100:1和10:1，随后用100ng / ml PMA活化3小时。将共培养物在室温下用0.25μMSytox橙标记5分钟，荧光强度通过酶标仪测量。含有Sytox橙的培养基作为背景荧光对照。荧光强度根据非活化对照的强度进行归一化。结果表示为五次测量的平均值±SEM。该实验独立重复三次，结果相似。 ** 0.01; *** 0.001; RFI，相对荧光强度; AU，任意单位。

将新鲜分离的嗜中性粒细胞以100μlR1培养基（参见方案2）每孔以1×10 5个嗜中性粒细胞的密度添加到96孔黑色平底板中。只有R1培养基，具有PMA活化的阳性对照和仅有嗜中性粒细胞阴性的DMSO的对照的背景荧光对照是必要的。
注意：为每个条件重复5个井。避免在板的第一行和最后一行/列中的井。（我们的经验是，板的外围孔可能会给出不准确的荧光读数，特别是四角的孔，这可能是由于酶标仪的技术规格或黑底96孔板的质量。）

添加感兴趣的治疗（见注释部分注1）
对阳性对照孔和需要形成NET的条件，加入终浓度为100ng / ml的PMA以活化嗜中性粒细胞。（即，，在R1培养基中稀释1mg / ml PMA原液1：100，然后向每个孔中加入1μl稀释的PMA）。

在R1培养基中稀释DMSO 1：100，向阴性对照孔的每个孔中加入1μl稀释的DMSO。

在37℃培养箱中孵育3小时。

在R1培养基中稀释5mM Sytox橙色储备液1：5,000。然后使用多通道移液管（即终浓度为0.25μM的Sytox橙），向每个孔中加入50μl的1μM工作溶液。

在黑暗中室温孵育5分钟。

将板以400×g离心5分钟，小心地从每个孔中除去100μl上清液以降低背景荧光。
注意：请缓慢小心地取下介质，避免接触底板。

立即用Mithras LB940微孔板读数器测量荧光强度，激发和发射波长分别为540 nm和580 nm（见注4）。}

数据分析

Sytox橙色测定荧光强度的计算

取平均5个R1中等重复条件。这是Sytox橙在培养基中的背景荧光
从所有其他样品的荧光强度读数中减去此背景荧光
每个条件平均5次重复。
将每个条件的荧光强度归一化为阴性对照（静息嗜中性粒细胞），其被设置为1个任意单位（AU）。

该测定应使用独立嗜中性粒细胞样品进行至少3次。数据可以以平均值±SD（或SEM）表示。无配对的双尾学生的 t测试可以用于显着性测试。

笔记

需要为每个治疗条件确定治疗的持续时间。为了研究靶细胞对NET形成的影响，应考虑适当的孵育时间，以允许在添加活化剂如PMA之前研究细胞与嗜中性粒细胞的相互作用。例如，为了研究间充质干细胞（MSC）或人真皮成纤维细胞（HDF）对NET形成的影响，在37℃的培养箱中将嗜中性粒细胞与MSC或HDF共培养2 h， > et al。，2016）。
PMA用于人为触发NET形成，例如，作为阳性对照。在抑制潜在治疗的NET形成的条件下，中性粒细胞也被PMA人工激活。然而，如果潜在的治疗预期会诱导NET形成（例如，细菌），则不需要添加PMA。
NET的免疫染色模式在人和小鼠嗜中性粒细胞中看起来不同。来自人嗜中性粒细胞的NET纤维长得多，并且显示更加突出的网络结构。小鼠骨髓嗜中性粒细胞的NET形成能力较弱，但可通过添加钙来激活组氨酸的瓜氨酸化来增强，这对于NETosis很重要。关于图2B中的几个细胞核，根据我们的经验，与人嗜中性粒细胞相比，小部分小鼠嗜中性粒细胞经历NETosis。氧化爆发和其他激活过程导致细胞死亡，而不粘附于盘子。
已经对来自BMG Labtech（Ortenberg，Germany）的单色仪的微孔板阅读器CLARIOstar进行了Sytox橙色测定，并且在547nm的激发和570nm的发射下很好地工作。
从血沉棕黄层分离的人嗜中性粒细胞的活力和纯度取决于样品的新鲜度。在收集的12小时内，嗜中性粒细胞的预期存活率高于80％。梯度离心和MACSxpress方法的预期纯度都高于80％。在两种方法分离的嗜中性粒细胞的功能反应中没有观察到差异
一般来说，建议使用不同的量化方法来评估NETs，并将其与免疫荧光显微镜结合以显现NETs。 Sytox orange测定法可用作体外实验的简单NET定量方法。对于体内条件，推荐使用嗜中性粒细胞标志物以及可以检测脱色染色质的NET组分抗体的证明。

食谱

FACS缓冲液（可在4℃保存2周）
含有0.5％FBS，0.02％NaN 3，pH 7.4的PBS
R1培养基（制备的培养基可以在4℃保存2周） RPMI1640培养基
1％FBS
1x GlutaMAX
1x MEM NEAA
1x青霉素/链霉素
阻塞缓冲区（准备新鲜）
含有5％BSA和5％山羊血清的PBS
抗体稀释剂（准备新鲜）
含有1％BSA的PBS

致谢

这项工作部分得到巴登 - 符腾堡基金会（P-BWS-ASII / 15），欧洲委员会（CASCADE HEALTH-FP7-223236）和德国研究基金会（SFB1149）向KS-K提供的研究资助。来自乌尔姆大学医学院（LSBN.0100）至DJ的Baustein计划，以及卓越集群心肺 - 系统（ECCPS）至MS一些数字是从近期江泽民的研究报告（2016年）进行了调整和修改的。

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