材料和试剂

1.5ml微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
200μlPCR管（Labomedic，目录号：2081644AA）
培养皿（SARSTEDT，目录号：82.1472）
2 ml微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.691）
20μl移液器吸头（SARSTEDT，目录号：70.1116）
200μl移液器吸头（SARSTEDT，目录号：70.760.012）
1,000μl移液器吸头（SARSTEDT，目录号：70.762.010）
农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）（根癌农杆菌）菌株GV3101 :: pMP90
拟南芥种子（Col-0）
向量（见图1）

图1. pUB-Cas9（A）和pFH6（B）的载体图。 pFH6用于整合sgRNA支架上游的20bp靶序列并在拟南芥U6-26 RNA聚合酶III启动子的控制下。然后将整个sgRNA盒通过吉布森克隆转移到用于植物转化的二元T-DNA载体pUB-Cas9（含有在Ubiquitin10启动子控制下的Cas9 基因）。使用SnapGene Viewer生成地图（ http://www.snapgene.com/ products / snapgene_viewer / ）。
1. 含有密码子优化（UBIQUITIN10启动子）密码子优化的植物T-DNA Cas9载体pUB-Cas9（GenBank登录号KY080691）表达Cas9 基因，用于细菌选择的卡那霉素抗性盒和作为植物选择标记的潮霉素抗性盒（Hahn等人，[2017];可在Addgene获得，目录号：86556）
2. 含有拟南芥U6-26启动子的sgRNA亚克隆载体pFH6（GenBank登录号KY080689），20bp原始序列的整合位点，sgRNA支架和氨苄青霉素抗性盒（Hahn等） [2017];可在Addgene获得，目录号：86555）
  注意：pFH6在U6-26启动子的3'末端和原始聚合酶整合位点之间包含另外的9bp片段（GTCCCTTCG）。在几个实验中，我们可以显示这不影响基因编辑活动。然而，我们还克隆了新版本的亚克隆载体，而没有附加片段（pFH6_new），其在初步实验中显示出高的切割活性，并且可以从我们获得。该版本仅在U6-26启动子的3'末端和原始聚合酶整合位点之间仅含有另外的鸟嘌呤（G），其允许任何20bp原始样品的整合而不限制G作为第一个碱基对（比较例如Fauser等[2014]）。 pFH6_new的克隆策略类似于本协议中描述的克隆策略，唯一的区别是克隆您的20 bp原始序列序列的正向引物含有不同的重叠，并且在开始时缺少初始G的需要（ATTG-N20，比较程序部分）。
感受态的大肠杆菌（E.coli）细胞（例如，，Mach1 ^{TM感受态细胞，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM ，目录号：C862003）}}
I-HF + CutSmart缓冲液（New England Biolabs，目录号：R3539S）
蒸馏H 2 O O
质粒微型制备试剂盒和琼脂糖凝胶提取试剂盒（例如，1碱性DNA纯化试剂盒中的GeneMATRIX 3，Roboklon，目录号：E3545）
T4 DNA连接酶与10x连接缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0202S）
氨苄青霉素（Amp）（Carl Roth，目录号：K029.2）
引物（见表1）

表1.寡核苷酸列表
5x Green GoTaq反应缓冲液（Promega，目录号：M791A）
dNTP（每种10mM）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：R0192）}
GoTaq G2聚合酶（Promega，目录号：M7841）或其他标准PCR聚合酶
III-HF + CutSmart缓冲液（New England Biolabs，目录号：R3104S）
Kpn I-HF + CutSmart缓冲液（New England Biolabs，目录号：R3142S）
Phusion高保真聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0530S）或其他校对聚合酶
吉布森装配克隆试剂盒（New England Biolabs，目录号：E5510S）
硫酸卡那霉素（Kan）（Carl Roth，目录号：T832.4）
利福平（Rif）（Molekula，目录号：32609202）
硫酸庆大霉素（Gent）（Carl Roth，目录号：0233.3）
潮霉素B（Hyg）（Carl Roth，目录号：CP12.2）
T7内切核酸酶I（可选; New England Biolabs，目录号：M0302S）
LB培养基（琼脂平板和液体），补充200μg/ ml氨苄青霉素（参见食谱）
LB培养基（琼脂平板和液体），补充有30μg/ ml硫酸卡那霉素（参见食谱）
补充有150μg/ ml利福平，50μg/ ml硫酸庆大霉素，50μg/ ml卡那霉素的YEP培养基（琼脂平板和液体）（参见食谱）
补充有33.3μg/ ml潮霉素B（参见食谱）的1/2 MS培养基琼脂平板

设备

琼脂糖凝胶电泳设备（例如，VWR，Peqlab，型号：PerfectBlue 凝胶系统Mini M，目录号：700-0434）
细菌培养箱（28℃，37℃，例如，Memmert，型号：IN55）和振荡器（28℃，37℃;例如，Eppendorf，New Brunswick ^{TM ，型号：Innova ^{® 44，目录号：M1282-0002）}}
加热块（例如，Eppendorf，型号：Thermomixer Compact，目录号：T1317-1EA）
PCR循环仪（例如，Thermo Fisher Scientific，Applied Biosytems ^{TM，型号：Veriti 96孔热循环仪，目录号：4375786） br />}
10μl移液管（例如，，Pipetman Neo P10N，Gilson，目录号：F144562）
20微升移液管（例如，，P20N，Gilson，目录号：F144563）
200μl移液管（例如，，P200N，Gilson，目录号：F144565）
1,000μl移液管（例如，，P1000N，Gilson，目录号：F144566）
植物生长室（例如，CLF Plant Climatics，Percival Scientifici，型号：AR-66L）

软件

SerialCloner
Cas-OFFinder
4Peaks软件
MUSCLE（可选）

程序

基因敲除的sgRNA序列的设计
sgRNA的设计可能是Cas9介导的基因编辑最关键的一步。因此，应仔细选择Cas9目标站点。 2014年的许多在线工具（Heigwer等人，2014; Lei等人，2014; Xie等人，2014）帮助找到合适的然而，我们仍然在标准分子生物学软件（例如，SerialCloner， http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html ）。选择目标网站时，应考虑以下几个方面：
1. 搜索推定的非目标网站，以避免敲除共享20 bp目标网站或高度相似的网站的基因。为此，我们使用可在，2014） .net / cas-offinder /“target =”_blank“> http://www.rgenome.net/cas-offinder/ 。在这里，我们使用以下设置：
  PAM型：来自化脓性链球菌的SpCas9：5'-NRG-3'（R = A或G）
  目标基因组：拟南芥（TAIR 10）
  不匹配号码：3
  在参考基因组中搜索您的20 bp目标位点后，该程序将显示所有类似的站点，最多3个不匹配。如果您有多个不匹配的命中（一个总是您的 GOI ），则应选择其他目标站点。如果您有1-3个错配，您应该考虑到Cas9也可能会诱变这些位点，特别是如果这些错配位于20 bp序列的5'末端（Semenova等人，2011年））。尽管对Cas9的亲和力将低于您的GOI ，但植物似乎一般较少受到目标定位的影响（Feng 等人，2014），我们建议在敲除植物中仔细测序这些目标位点，以确保这些基因不存在突变

将20 bp原始序列亚克隆到pFH6中

概述如何将原始序列亚克隆到pFH6中，如图2所示
为您的候选靶序列N <20>订购正向和反向引物，重叠用于克隆，并将其稀释至10μM的最终浓度（f.c.）。
正向引物：TTCG-GN
反向引物：AAAC-N19（反向互补）C（参见图2）

图2.原生质体序列在pFH6中的亚克隆。通过连接二聚引物可将20bp原始序列序列整合到sgRNA支架和U6-26启动子（U6p）之间进入我消化的pFH6载体。
将10μl每个引物稀释液吸取到1.5 ml微量离心管中并混合
加热底漆混合至98℃，10分钟，然后55℃，10分钟，然后通过关闭加热块缓慢冷却至RT（例如，）。通过这样做，将产生包括您的原始序列（=退火引物）的双链DNA。
在37℃下将pFH6与bbs I-HF消化3小时。
在琼脂糖凝胶上运行限制性消化，并使用1碱基DNA纯化试剂盒中的GeneMATRIX 3从凝胶中提取载体骨架（3,612bp）。
在4℃下将经消化的pFH6的退火引物连接过夜
转换胜任的电机大肠杆菌细胞与连接反应，并将转化的细胞在补充有Amp。
的LB琼脂平板上扩散注意：通常，电镀100μl的转化混合物就足够了。转基因大肠杆菌细胞的方案是根据要求提供的。
验证八。大肠杆菌菌落通过菌落PCR，使用引物M13R和您的原标本引物TTCG-N <20>进行以下设置：

PCR程序：

注意：我们建议使用pFH6作为阴性对照。我们有时在阴性对照中观察到预期条带大小（281 bp）的片段，因为原始标记引物可能部分结合BbsI位点。然而，阳性菌落通常具有更强的PCR产物信号，因此可以区分于阴性克隆。
在补充有Amp的LB培养基中接种阳性菌落并生长过夜
使用1碱基DNA纯化试剂盒中的GeneMATRIX 3纯化质粒
使用引物M13R对质粒进行序列并验证原始序列插入序列（表1）

使用吉布森装配克隆最终植物T-DNA Cas9载体

概述如何克隆最终植物T-DNA Cas9载体在图3中给出。

图3.产生具有用于Cas9诱导诱变的所有必需组分的植物T-DNA载体。包含20bp靶位点的sgRNA盒从pFH6扩增并整合到Kpn中> I / em> Hind III-消化的pUB-Cas9通过吉布森装配。所得载体包含在UBIQUITIN10启动子（UB10p）和潮霉素（UG10p）控制下的sgRNA盒以及Cas9基因，）抗性基因作为选择标记。 RB，右T-DNA边界; PolyT，多胸苷转录终止子; NLS，核定位信号; NosTm，胭脂碱合酶终止子; CaMV35S，花椰菜花叶病毒2x35S启动子; 35STm，35S终止子; LB，左T-DNA边界。
消化载体pUB-Cas9与Hind III-HF和Kpn I-HF在37℃下培养3小时。

注意：pUB-Cas9质粒的高效消化对于进一步克隆步骤至关重要。如果您在随后的克隆步骤中遇到问题，请尝试用新鲜的酶和更长的孵育时间消化pUB-Cas9。
在琼脂糖凝胶上排除限制性消化反应，并使用Gene-Basic DNA纯化试剂盒中的GeneMATRIX 3从凝胶中提取载体骨架（14,097bp）。
使用引物FH41和FH42（表1）和Phusion高保真聚合酶扩增具有靶序列的pFH6的sgRNA盒（预期大小：771bp）和以下设置：

PCR程序：
在琼脂糖凝胶上运行PCR反应，并使用Gene-Basic DNA纯化试剂盒中的GeneMATRIX 3从凝胶中提取sgRNA盒（771bp）。
组装pUB-Cas9骨架和sgRNA盒，根据制造商的说明书，孵育时间为1小时，使用Gibson Assembly Master Mix生成最终载体pUB-Cas9- @ GOI。
注意：我们提出了最终结构的命名，其中目标基因由@ -sign标记。因此，针对拟南芥GL1基因设计的载体称为pUB-Cas9- @ GL1（Hahn等，2017）。
转变主管大肠杆菌细胞与吉布森反应混合物，并将转化的细胞在补充有Kan的LB琼脂平板上铺展。
注意：新英格兰Biolabs在吉布森装配克隆试剂盒中提供高度感受态的大肠杆菌细胞。然而，我们也使用我们实验室生产的感受态大肠杆菌细胞。由于这些通常的能力较差，我们建议在LB琼脂平板上电镀所有转化的细胞。在Sambrook和Russell（2006）中可以找到用于产生感兴趣的MachI大肠杆菌的方案。
使用引物M13F和FH179（表1）通过菌落PCR验证8个阳性菌落，并使用以下设置：

PCR程序：

注意：预期产品大小为779bp，pUB-Cas9载体可用作阴性对照。
将阳性菌落接种到补充有Kan的LB培养基中，并使之生长过夜。
使用1碱基DNA纯化试剂盒中的GeneMATRIX 3纯化质粒
使用引物FH179和M13F（表1）对质粒进行序列测序以验证原始序列插入注意：载体系统还允许将两个不同的sgRNA克隆到pUB-Cas9载体骨架中，以在靶基因组中诱导大的缺失或一次破坏两个基因。因此，如所述，两个原始序列必须分别克隆到pFH6中。然后，使用引物FH41和FH254，必须从其亚克隆pFH6构建体扩增第一个sgRNA盒（表1）。使用上述PCR条件，第二个sgRNA盒必须用FH42和FH255扩增（表1）。使用Gibson Assembly Master Mix，两个盒可以在一个步骤中整合到KpnI-HF / HindIII-HF消化的pUB-Cas9中。由于两个片段整合到消化的载体中，与一个片段的整合相比，菌落的量通常较低。然而，正确组装的载体的比例是可比的。菌落PCR可以用相同的引物进行，但使用较长的延长时间（1.5分钟），因为PCR反应扩增了两个sgRNA盒（预期产物大小：1,512bp）。应按上述方式进行排序。

所有克隆步骤总结在表2中：

表2.用于克隆靶向基因敲除的植物T-DNA Cas9载体的时间表

使用pUB-Cas9- @ GOI进行拟南芥转化

转变主管根瘤土壤杆菌细胞与1μg的pUB-Cas9- @ GOI接种，并将转化的细胞扩散到补充有Rif / Gent / Kan的YEP琼脂平板上。
注意：在其他地方描述了用于产生根癌农杆菌细胞和转化根癌农杆菌细胞的方案（Hofgen和Willmitzer，1988）。
在30℃生长两天后，使用引物FH61和FH201通过菌落PCR验证质粒在至少三个菌落中的存在（表1）。为了验证菌落，用移液管吸头取一个菌落的一半，并将细胞悬浮在含有100μlddH 2 O的1.5ml微量离心管中。加热至98℃10分钟，并使用2μl作为PCR的DNA模板。将另一半的菌落在补充有Rif / Gent / Kan的新鲜YEP琼脂平板上。在30°C生长细胞一天，然后在4°C储存。对于菌落PCR，请使用以下设置：

PCR程序：

注意：预计产品大小为1,003 bp。
使用农杆菌介导的T-DNA转移与花浸渍方法（Clough and Bent，1998）一起转化拟南芥植物。
注意：每个建筑物，我们通常用五个拟南芥植物改造四盆。我们建议在转化前删除所有现有的长角色，以避免以后对转化事件的过度筛选。
在补充有Hyg的1/2强度MS琼脂平板上选择T1代植物以获得成功的T-DNA插入事件。通过使用前面描述的参数的引物FH61 / FH201，通过分离叶基因组DNA（gDNA）和随后的PCR来验证T-DNA的整合。
注意：通过异丙醇沉淀的植物gDNA提取的详细方案可以在别处找到（Weigel和Glazebrook，2009）。