材料和试剂

移液器和无菌提示
无菌离心管（例如，Falcon，50ml）圆锥形离心管）
无菌细胞培养瓶（例如，例如，25cm 2，Nunc＆lt; E＆amp; E＆gt; EASYFlasks＆lt;＆gt;）*
24孔，细胞培养板，平底（Corning，Costar ®/或类似）
无菌1.5 ml Eppendorf管
50ml Falcon管（康宁或类似）
无菌过滤器（Corning）的无菌过滤器（0.2μm）
<盘>盘根杆菌AX4（或其他无性菌株;可在美国伊利诺斯州芝加哥西北大学Dicty Stock Center的Dicty Stock Center获得）
细菌培养*
庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1264）
硫酸二氢链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1517）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：93443）
Oxoid TM 胰蛋白胨（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：LP0042）
Oxoid TM 酵母提取物（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：LP0021）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S9390）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：435570）
注意：本产品已停产。
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：310166）
注意：本产品已停产。
琼脂
无菌HL5培养基（见食谱）
SorC缓冲液（参见食谱）
无菌Luria肉汤（LB）（见食谱）
琼脂平板与Luria琼脂（见食谱）

注意：本方案描述了我们用于比较不同大肠杆菌菌株的存活率的方法，但可以使用其他细菌。这是细菌对庆大霉素敏感的要求

设备

移液器
层流罩（Heraeus，型号：Air HLB 2472）
125ml锥形瓶
旋转振荡器，在22°C温育
37℃恒温箱（Thermo Fisher Scientific）*
旋转振荡器，在37℃下孵育*
用于eppendorf管的台式离心机（4℃冷却）（Eppendorf，型号：5424R）
离心机用于50ml Falcon管（HERMLE LABORTECHNIK，型号：Z 326 K）
分光光度计和各自的比色皿（600nm）
高压灭菌器（STIK，型号：MJ系列）
涡旋混合器（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2，目录号：SI-0236）
pH计和校准缓冲液
倒置显微镜（Olympus，型号：CKX31）**
显微镜（Nikon Instruments，型号：ECILPSE 80i）
Neubauer血细胞计数器具有双重计数室（Gizmo Supply，德国）

注意：设置在37°C的孵化器对于与大肠杆菌一起工作是必要的，但如果使用其他细菌，生长温度条件当然应该相应地进行修改。
注意：在实验过程中，倒置显微镜对于培养瓶和细胞培养板的检查非常有用。

程序

注意：

所有的工作都是在无菌条件下使用层流罩进行的。
实验用盘基网柄菌的液体无菌培养物进行。 D. discoideum菌株通常设在板上（例如，从Dicty股票中心）。在开始实验之前，应将变形虫带入液体培养。有关培养盘根杆菌的详细和有用的信息，请参见Dicty股票中心的首页， http： //dictybase.org/ （Fey et al。，2007）。
细胞培养瓶中的盘牙菌丝的先前培养具有允许直接检测培养物的优点，但也可以在摇动液体培养物例如125ml锥形瓶中培养培养物。这可以使得在培养物中更容易获得高细胞密度。
如果提供洗涤的热杀菌细菌，则可以改善盘根杆菌的生长。我们以前已经使用大肠杆菌的过夜培养物，其通过离心洗涤，重悬于SorC中并在65℃下热灭活10分钟。
在这个协议中，我们使用不同的大肠杆菌菌株。该程序可用于其他细菌;在这种情况下，细菌特异性生长条件，细菌细胞密度等估计的光密度（OD）应相应修改。

第一天开始。 discoideum 文化
1. 加入500μl2-3天的老鼠。在无菌培养瓶中培养至10ml新鲜无菌HL5。
2. 将培养瓶在22℃孵育（不摇动）
第2天（-3）。开始细菌培养
1. 通过接种具有1％接种物E的25ml无菌LB培养基来开始细菌培养。大肠杆菌培养物（过夜生长）在125ml锥形瓶中
2. 在旋转振荡器上在37℃，200rpm下孵育过夜。
第3天（-4）。生存检测
1. 收获细菌
  1. 通过以12,000×g离心2分钟收获1ml细菌。
  2. 通过小心地移取液体去除上清液，而不会干扰沉淀。
  3. 将细菌沉淀重悬于1 ml的1：4 HL5：SorC溶液中
  4. 以12,000 x g离心2分钟。
  5. 去除上清液并将细菌沉淀重悬于1ml的1:4 HL5：SorC溶液中
  6. 将细菌密度调节至0.1（约10 CFU ml -1）的OD 600。
  7. 收获D.单核细胞
    1. 在50毫升Falcon管中加入亚麻培养物，并以500克xg离心4分钟。
    2. 通过小心地移取液体去除上清液，而不会干扰沉淀。
    3. 将阿米巴重悬于25 ml的1：4 HL5：SorC溶液中
    4. 以500 x g离心4分钟。
    5. 重新使用1：4 HL5：SorC溶液中的变形虫。
    6. 通过在血细胞计数器中计数来估计悬浮液中的变形虫密度。
    7. 将变形虫密度调整至1×10 6细胞ml -1 。
  8. 加入庆大霉素
    1. 将24孔细胞培养板中的每个孔的内容物转移到1.5ml Eppendorf管中
    2. 以500 x g离心4分钟。
    3. 通过小心地移取液体去除上清液，而不会干扰沉淀。
    4. 加入1ml SorC缓冲液
    5. 以500 x g离心4分钟。
    6. 通过小心地移取液体去除上清液，而不会干扰沉淀。
    7. 重复步骤C4d-C4f。
    8. 加入含有400μg/ ml庆大霉素的1ml SorC。
    9. 在室温下孵育1小时。
  9. Lyse变形细胞并计数内在细菌

数据分析

使用约20-200个菌落的琼脂平板计算每个重复孔的每ml的菌落形成单位数（CFU）。通过单因素方差分析CFU在不同治疗方法中的数量，然后进行对比手段的检验。我们使用了邓肯的测试（郝等人，2016），但其他测试也同样适用。在上面的例子中，我们只比较了两个菌株，这里我们使用了一个 t -test（图1）。
注意：两种对照处理（步骤C3d和C3e）应不含细菌。细菌在没有细菌的阴性对照中的存在（步骤C3d）表明，变形虫培养物被细菌污染，实验将不得不用新建立的无污染细菌的无菌亚麻培养物重复。没有变形虫的对照处理中的细菌存在（步骤C3e）表明细菌没有被庆大霉素有效杀死，数据不能用于评估细菌的存活。

图1.与的野生型菌株共培养的 <强>电子。大肠杆菌（W3110）和具有三重基因缺失的突变体E345 。以MOI 1进行测定。> -test，并且两个菌株在1％水平（每个菌株的p = 0.0045，n = 6）显着不同。更多的细节和例子可以在昊等人的中找到。

食谱

无菌修饰HL5
14.0克胰蛋白胨（Oxoid）
7.0克酵母提取物（Oxoid）
0.35g Na 2 HPO 4 <7H 2 O
1.2g KH 2 PO 4
将组分溶解在937.5ml蒸馏水中，用HCl调节pH至6.4-6.7，高压灭菌20分钟消毒
通过0.2μm无菌膜过滤器过滤，制备无菌的葡萄糖溶液（224 g L -1）。加入62.5毫升此溶液至937.5毫升高压灭菌的溶液上方（0.05g L 二氢链霉素硫酸盐*）
注意：当培养物开始或被细菌污染时，添加二氢硫酸链霉素 - 硫酸盐可能是有用的。然而，对于实际实验的预培养，我们避免使用抗生素，因为抗生素可以与我们的细菌生存测定相互作用。
SorC缓冲区
2.0g L -1 KH 2 4
0.29g L Na 2 HPO 4
溶解在蒸馏水中，检查pH值为6.0±0.1，如果不用HCl调整，则不能向1升SorC溶液中加入1毫升50毫摩尔CaCl 2，高压釜
无菌Luria肉汤（LB）
10.0 g L -1 胰蛋白胨
5.0g L -1 酵母提取物
10.0g L -1 NaCl
将组分溶于蒸馏水中，用HCl调节pH至6.8-7.2，高压灭菌20分钟
琼脂板与Luria琼脂
向Luria Broth添加15.0 g L -1 琼脂高压釜和倒板
注意：确保计算实验所需的琼脂平板数量。请记住，对于每种细菌菌株，您需要从添加细菌的复制品（步骤C3a-C3b）和没有变形虫杆菌（步骤C3e）的对照板中平铺样品。此外，除了用细菌菌株进行处理之外，还应制备用于使用变形虫控制处理但没有添加细菌的平板（步骤C3d）。

致谢

研究实验室由福建农林大学创业基金和福建省百人计划资助。作者要感谢沙特阿拉伯国王沙特阿拉伯国际博士后研究奖学金计划（第20050079号）和沙特阿拉伯国王沙特阿拉伯大学的特拉索尔研究优秀计划“TRE计划”。哥伦比亚大学富兰布赖特大学荣获富布莱特学者奖学金。这个协议是由郝等人于2016年出版发行的。

参考

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