材料和试剂

设备

程序

通过Bench离心机通过低速离心（4,500×g×10分钟）在指数生长期（OD值550和0.8之间）收集100ml培养物，从100ml的藻类文化。丢弃上清液，将沉淀重新悬浮在3ml 5％（w / v）磺基水杨酸中，并通过涡旋混合。
注意：将磺基水杨酸添加到颗粒中以对GSH的稳定性（Stempak等人，2001）的保护作用，还用于从样品中去除蛋白质。
通过两次通过法国压力池（1,100psi）使细胞裂解。通过Superspeed离心机在4℃下以11,000 x g离心20分钟。使用所得上清液作为粗提物（CE），并测定其为谷胱甘肽含量。
注意：其他方法和程序可用于裂解Galdieria细胞;在最常见的方法中，使用磁力搅拌器，微波辐射，超声波和酶处理（Dvoretskyet等，2016; Farooq等，2016; Huang等，2016）。可以用光学显微镜观察细胞的断裂。
使用前将粗提物放在冰上。
注意：需要在准备2小时内使用谷胱甘肽测定的CE;事实上，在2小时后，在冷冻后，观察到GSH含量急剧下降。

校准曲线的准备
谷胱甘肽水平的定量是基于还原形式的谷胱甘肽（GSH）。校准曲线用0-500μM标准GSH溶液进行。在412nm处计算出的摩尔消光系数（ε）估计为0.017mM -1 -1.0 。
还原和总谷胱甘肽的测定

为了测定还原型谷胱甘肽（GSH）含量，加入1.5ml比色皿600μl反应缓冲液，40μl0.4％（w / v）DTNB，10-100μlCE和Milli-Q水，终体积为1,140 μl，轻轻混匀。空白溶液中含有除CE以外的所有试剂。
注意：DTNB溶液可以制备，等分并储存在-20°C六个月。
在室温下孵育反应杯5分钟，并使用分光光度计测量412nm处的吸光度
为了确定总谷胱甘肽，加入已经存在于比色皿中的反应混合物，50μl的0.4％NADPH和1μl的GR（0.5U）。
在室温下孵育反应杯30分钟。轻轻混合，用分光光度计在412 nm读取吸光度注意：对于比色皿测定法已经改进了该方法，但是适应微孔板测定是可能的。

数据分析

GSSG含量计算为总谷胱甘肽与GSH含量之间的差异。
硫醇水平用nmol ml -1提取物表达。每个样品中的谷胱甘肽含量与通过Bürker腔确定的细胞数相关
在对照培养物中预期的GSH的近似浓度应为约0.8pmol 10℃-5细胞 -1。此外，同一提取物中的总谷胱甘肽的浓度应为约3.3 pmol 10至-5细胞 -1 。

食谱

致谢

该协议是从先前发表的研究（Anderson，1985; Bashir等人，2013）中改编的。本研究由Regione Campania（PON-Smart Generation和LR 5/2002）资助。

参考