材料和试剂

移液瓶头（20μl，200μl，1000μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：3521-HR，3551-HR，3101-05-HR）}
1.5ml Eppendorf管（Eppendorf，目录号：T9661-1000EA）
剥离PCR管和帽（Roche Diagnostics，目录号：1667009001）
PowerSoil ^{TM DNA分离试剂盒（Mo Bio Laboratories，目录号：12888-100）}
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
预混料Taq （Takara Bio，目录号：R004A）
dNTP混合物
Tris-HCl（pH 8.3）
氯化钾（KCl）
氯化镁（MgCl 2）
AxyPrep ^TM PCR清除试剂盒（Corning，Axygen ，目录号：AP-PCR-250）
引物

设备

移液管（0-10μl，10-100μl，100-1,000μl）（Eppendorf，目录号：k03030，k03031，k03032）
Vortex-genie ^TM 2（Mo Bio Laboratories，型号：Vortex-Genie 2）
PICO 17离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM型号：Heraeus ^TM Pico ^TM 17）
自动热循环仪TP600（Takara Bio，型号：TP600）

软件

程序

样品收集和核酸提取
根据制造商的说明书，使用PowerSoil ^TM DNA隔离试剂盒（Mo Bio Laboratories，USA）从土壤或沉积物样品（0.25g湿重）中提取基因组DNA。
THDP-PCR方法（图1）

图1. THDP-PCR的原理
1. THDP-PCR的第一步
2. PCR清理
  根据制造商的说明书，使用AxyPrep ^TM PCR清除试剂盒（Axygen，China）纯化第一步PCR产物的整个体积（50μl），以除去未结合的简并引物。
  注意：未结合长标记的3'末端不匹配的简并引物也将结合模板，但不会引发聚合，从而防止单标记引物与第一步PCR产物的结合，因此PCR清除
  需要两个步骤
3. THDP-PCR的第二步
  1. PCR反应配方。最终体积：50μl
    ħ 2 O 17-19μl
    标签条码（10μM） 4μl
    PCR清理产品 2-4μl
    注意：包括负控制样本。
    Premix Taq （见表1） 25μl
  2. 自动热循环仪程序
    1）94℃变性5分钟
    2）35-40个周期：
         94°C 1分钟
         59°C 1分钟
          72°C 1分钟
    3）72℃10分钟
  注意：第二步PCR中使用的清理产品体积和循环次数可以进行调整，以适应不同种类的样品。对于一些低丰度的样品，尝试将清洁产品体积增加到4μl，循环数增加到40。
焦磷酸测序
根据制造商的说明书，通过Roche_454焦磷酸测序（GS FLX Titanium System）将来自不同样品和序列的THDP-PCR产物混合在一起。

数据分析

修剪焦磷酸测序读取使用长度为>的mothur中的命令trim.seqs。 300和q> 25，并且不允许有歧义的序列。
使用功能基因管道/存储库中的FrameBot工具将修剪的序列翻译成氨基酸序列（ http ：//fungene.cme.msu.edu/）去除潜在的不能转化为CuMMO相关氨基酸序列的非特异性序列。
注意：根据该步骤的结果，可以使用从修剪序列的mothur中的命令get.seqs检索可以通过翻译的核苷酸序列。以下分析步骤基于检索的核苷酸序列，而不是多肽。
使用命令chimera.uchime和mothur中的remove.seqs来识别和删除嵌合体。
通过条形码序列将序列分成不同的样本，使用mothur中的命令split.seqs。
使用扩展的CuMMO数据库，使用BLAST和MEGAN中的最低共同祖先方法对拆分序列进行分类。
注意：此步骤中使用的原始数据库和参数由Dumont等人解释。（2014）在文章和补充文件中。 Wang等人扩展了分类中使用的参考数据库。（2017）从原始数据库中适用于高度退化引物的广泛覆盖，详细信息列在文章和补充文件中（Wang et al。，2017）。

致谢

这个协议是从我们以前的研究（Wang等人，2017年）中改编的。这项工作得到了国家自然科学基金委（NSFC）[拨款号31470222,31170114]的支持。

参考

Dumont，MG，Luke，C.，Deng，YC和Frenzel，P.（2014）。多重引物 - 模板错配对定量PCR准确性的影响以及用于准确定量pcrA基因序列变体的多引物组测定的开发微生物方法 94（3）：224-231。
Tuomivirta，TT，Yrjala，K.和Fritze，H。（2009）。使用新型反向引物的pmoA的定量PCR与芬兰芬的潜在甲烷氧化相关。 Res Microbiol 160（10）：751- 756.
Wang，JG，Xia，F.，Zeleke，J.，Zou，B.，Rhee，SK and Quan，ZX（2017）。一种具有靶向含铜膜结合单加氧酶基因的高度简并引物的改进方案，用于甲烷和氨氧化细菌的社区分析。 > FEMS Microbiol Ecol 93（3）：fiw244。