材料和试剂

注意：等效的材料和试剂可用作替代品。

离心管（50ml）（VWR，目录号：21008-242）
带过滤器的吸头（0.1-10μl）（VWR，目录号：89368-972）
带过滤器的吸头（1-200μl）（VWR，目录号：89003-056）
带过滤器的吸头（100-1,000μl）（VWR，目录号：89003-060）
PES膜真空过滤器（0.22μm）（VWR，目录号：10040-468）
离心管（15 ml）（VWR，目录号：21008-216）
微量离心管（VWR，目录号：87003-294）
纤维素注射器过滤器（0.22μm）（VWR，目录号：28145-477）
培养皿（100 x 15毫米）（VWR，目录号：25384-088）
分光光度计比色皿（VWR，目录号：97000-586）
注射器（10ml）（BD，目录号：309604）
注射器（3 ml）（BD，目录号：309657）
离心聚丙烯瓶（400ml）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：75007585）}
用于蛋白质纯化的一次性重力流动柱（Geno Technology，G-Biosciences，目录号：786-169）
S上。表达表达 LM1680表达p crispr / Csm2 <6h> （Hatoum-Aslan等人，2013）（参见注1） />
S上。金黄色葡萄球菌 RN4220表达p / Csm2 <6h> （Hatoum-Aslan等人，2013）（参见注1） />
HisPur Ni-NTA树脂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：88222）}
Sera-Mag ^{TM 磁性链亲和素包被的珠粒（GE Healthcare，目录号：30152105011150）}
SDS PAGE Gel 0.75 MM'Snap-A-Gels ^{TM Mini Tris Glycine Precast Gels，Jule'（VWR，目录号：66025-389）}
彩色蛋白标准梯（New England Biolabs，目录号：P7712S）
脑内输注（BHI）肉汤（BD，BBL ^{TM，目录号：211060）的BBL ^TM}
Difco ^{TM脑输注（BHI）琼脂（BD，Difco ^{TM，目录号：241810）}}
氯霉素（Alfa Aesar，目录号：B20841）
100％乙醇（Decon Labs，目录号：V1016TP）
硫酸新霉素（AMRESCO，目录号：0558-25G）
氯化镁（MgCl 2）（AMRESCO，目录号：J364）
Tris（AMRESCO，目录号：0497）
盐酸（HCl）（VWR，BDH ，目录号：BDH3030-2.5LPC）
氯化钾（KCl）（VWR，BDH ，目录号：BDH9258-500G）
EDTA，二钠盐，二水合物（EMD Millipore，OmniPur，目录号：4050）
氢氧化钠（NaOH）（AMRESCO，目录号：0583）
十二烷基硫酸钠（SDS）（VWR，目录号：97064-862）
溴酚蓝（VWR，目录号：97061-690）
Ambicin ^{®（重组溶葡萄球菌素）（AMBI，目录号：LSPN-50）}
无水乙酸钠（NaOAc）（AMRESCO，目录号：0602）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（AMRESCO，目录号：0571）
氯化钠（NaCl）（VWR，BDH ，目录号：BDH9286）
甘油（AMRESCO，目录号：M152）
β-巯基乙醇（β-ME）（Geno Technology，G-Biosciences，目录号：BC98）
考马斯蓝G-250（AMRESCO，目录号：M140-10G）
甲醇（VWR，BDH ^{®，目录号：BDH20864.400）}
乙酸（HAc）（VWR，BDH ，目录号：BDH3096-2.5LPC）
Tris-glycine-SDS 10x缓冲液（AMRESCO，目录号：0783-5L）
咪唑（Alfa Aesar，目录号：A10221）
Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂迷你片，不含EDTA（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：88669）}
Triton X-100表面活性剂（EMD Millipore，目录号：TX1568）
氢氧化钾（KOH）（Alfa Aesar，目录号：13451）
媒体和抗生素（见配方）
1. 脑心脏输液（BHI）肉汤
2. 氯霉素原料（10mg / ml）
3. 新霉素原料（15mg / ml）
库存解决方案（见配方）
1. 1 M MgCl 2
2. 1M Tris-HCl，pH 8.3
3. 1M Tris-HCl，pH6.8。
4. 1 M KCl
5. 500mM EDTA，pH 8.0
6. 10％十二烷基硫酸钠（SDS）
7. 1％溴酚蓝
8. 2 mg / ml重组溶葡萄球菌素
9. 2x裂解缓冲液
10. 5x退火缓冲液
11. 5x蛋白加载缓冲液
12. 考马斯蓝染色溶液
13. 解决方案
14. 1x Tris-甘氨酸缓冲液
缓冲液在第4天准备净化 - 第1部分（见配方）
1. 洗脱缓冲液
2. 再悬浮缓冲液
3. 平衡缓冲器
4. 洗1个缓冲区
5. 洗2缓冲液

设备

Eppendorf Research ^{®加移液器组（Eppendorf，目录号：2231000222）或等效移液管，设定范围为1μl至1,000μl}
介质/储存瓶（250毫升）（VWR，目录号：10754-816）或等效物
锥形瓶（2升）（VWR，目录号：10545-844）或等效物
标准轨道摇床（VWR，型号：1000，目录号：89032-088），或可以轻轻转动凝胶染色和脱色的等效摇床
新不伦瑞克省I26孵育振荡器（Eppendorf，New Brunswick ^{TM，型号：I26，目录号：M1324-0008）或可保持37℃和180rpm的等效振荡培养箱}
Heraeus Multifuge X1R离心机系列（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Heraeus ^{TM Multifuge ^{TM X1 /目录号：75004251）或具有能够容纳400毫升瓶子的转子的等效冷冻离心机并施加13,000克离心力的xg}}}
通用水浴（VWR，型号：VWR通用水浴，目录号：89501-460）或能保持37°C的等效物
超声波清洗机 S-450模拟超声波仪（Emerson，Branson，型号：S-450，目录号：101-063-198）或等效超声波均质器，工作频率为20 kHz，尖端直径为3.2 mm
30毫升烧杯（康宁，PYREX ^{®，目录号：1000-30）或等效物}
数字干式加热器（VWR，目录号：12621-088）或能够加热高达95°C的等效块式加热器
磁珠分离架（Thermo Scientific，目录号：MR02）或能够收集磁珠的等效机架
高压灭菌器（Getinge）或相当的高压灭菌器能够在施加15 atm压力的同时加热到121°C
量筒（100毫升）（VWR，目录号：65000-006）或等效的
量筒（1L）（VWR，目录号：65000-012）或等效的
介质/储存瓶（1升）（VWR，目录号：10754-820）或等效物
介质/储存瓶（100ml）（VWR，目录号：10754-814）或等效物
介质/储存瓶（500毫升）（VWR，目录号：10754-818）或等效物
Ultrospec ^{TM 10细胞密度计（GE Healthcare，目录号：80-2116-30）或等离子分光光度计，可以测量600 nm悬浮液中细胞的密度}
Mini-PROTEAN四细胞（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-PROTEAN Tetra Cell，目录号：1658004EDU）或等效的垂直电泳系统
pH计Accumet ^{TM AB15 plus basic（Fisher Scientific，型号：Fisher Scientific ^{TM accumet ^{TM> AB15 + Basic and BioBasic ^{>，目录号：13-636-AB15P）或等效pH计，范围为0.000-10.000}}}}

程序

第一天制备培养基，试剂和单菌落
1. 在250ml瓶中（用于开始过夜培养）和1L BHI培养液在2L锥形瓶中进行100ml大脑心脏输注（BHI）肉汤（用于大规模繁殖和蛋白质纯化）（参见配方1 ）。
2. 准备食谱1中列出的抗生素。
3. 准备实验所需的所有库存解决方案（参见配方2）。
4. 连续冷冻库存的。表皮炎 LM1680轴承 / Csm2 ^{6HN （或金黄色葡萄球菌 RN4220轴承p crispr / Csm2 <6h>在含有10μg/ ml氯霉素的BHI琼脂平板上。如果是。使用表皮炎，补充15μg/ ml新霉素的培养基（见注1）。}
第二天夜间文化准备
1. 将10ml BHI培养液转入50ml锥形管中
2. 加入10μl10mg / ml氯霉素，以选择p crispr / Csm2 ^{6HN 。如果是。表皮霉素正在使用LM1680，另加10μl15 mg / ml新霉素。如果使用其他菌株和质粒，则酌情补充培养基与抗生素（见注1）}
3. 用无菌移液器吸头，挑选一个单一的菌落。表皮炎 LM1680轴承 / Csm2 ^{6HN （或金黄色葡萄球菌 RN4220轴承p crispr / Csm2 ^{6HN ）。}}
4. 将菌落重新悬浮在含有适当抗生素的10毫升高压灭菌培养基中
5. 关闭松散的包含高压灭菌培养基，抗生素和感兴趣的菌落的50ml锥形管
6. 将细菌培养物在设定为180rpm的摇动培养箱中于37℃孵育16-20小时
第3天。过度表达Cas10-Csm复合物的细胞的大规模繁殖
1. 加入2L三角烧瓶中制备的1L BHI中，加入1ml 10mg / ml氯霉素。如果是。表皮霉素正在使用LM1680，另加1 ml 15 mg / ml新霉素。
2. 接种1 L BHI加抗生素与第2天制备的整个10ml过夜培养物。
  注意：表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌培养物的OD600 nm约为5-6。
3. 用细胞密度计测量稀释培养物的初始OD600nm，以便于估计达到最终OD600nm所需的时间（见下文）。
4. 在设定为180rpm的摇动培养箱中在37℃下培养细菌培养物。
5. 让细菌培养物生长直到OD600nm = 2.00（如果从新鲜的过夜培养开始，则初始OD600nm = 0.05），约7-9小时。
6. 将1升液体培养物分配到四个400毫升聚丙烯瓶中
7. 以5,000×g离心细胞，4℃10分钟。
8. 丢弃上清液，并用冰冷的蒸馏H 2 O（dH 2 O）的冰悬浮每个沉淀物。
9. 将细胞悬浮液从所有小丸混合到干净的50ml锥形管中（冰上），并以5,000xg离心4℃，10分钟。
10. 弃去上清液并将沉淀的细胞储存在-80°C（用于最佳纯化一周后）或直接进行纯化。
第4天净化 - 第1部分
1. 在冰上解冻细胞沉淀1小时。
2. 准备食谱3中描述的所有缓冲液。
3. 将解冻的沉淀物重新悬浮在9ml冰冷的dH 2 O中
4. 加入200μl1M MgCl 2和125μl新解冻的溶葡萄球菌素（2mg / ml储备液）。
5. 在37℃水浴中孵育细胞悬浮液1小时。孵育30分钟后将管反转数次，以使悬浮液均质化
6. 向裂解的细胞中加入10 ml再悬浮缓冲液，倒置管数次。细胞裂解物将变得非常粘稠（参见图2）
  
  图2.超声处理之前和之后的细胞裂解物的粘度。表皮细胞表达p / csm2 <6h>的LM1680细胞在超声处理之前（左），细胞裂解物是乳白色的，具有粘液的稠度。超声处理（右）后，细胞裂解物变成褐色，水分浓稠
重要提示：所有后续步骤都应在冰上或4°C下进行
1. 将Sonifier S-450调整至功率级6.0，占空比百分比调整为6.
  注意：这些设置对应于60 W功率输出，每秒固定重复频率为1个脉冲。 “6”的占空比表示每1秒脉冲（剩下的每秒40％）将发送60％的功率。
2. 将裂解液倒入冰桶中的30 ml烧杯中。细胞裂解液应占据烧杯体积的一半，使其内的裂解物至少有1英寸的深度。
3. 将超声波尖端浸入深度为1/2英寸的裂解液中，使得从烧杯底部保留约1/2英寸的间隙。
  重要提示：提示不要碰触烧杯的两侧或底部。
4. 一次在冰上超声处理裂解物30秒，间隔一分钟。该循环应重复三次，或直到裂解物具有更多的水分稠度。通常，裂解液也会获得棕色色调（见图2）
5. 将裂解液倒入50 ml锥形管中，以10,000 x g离心20分钟，4℃。离心后澄清的裂解物通常保留棕色色调（见图3）
  
  图3.第一次离心后超声处理的细胞裂解物的外观。细胞碎片沉淀后，澄清的裂解物保留黄棕色色调。
6. 将上清液倒入新鲜的50ml锥形管中，以13,000 x g离心20分钟，4℃。
  注意：可以在SDS-PAGE上保存细胞沉淀并检查Cas10-Csm复合物的存在以评估其溶解度。
7. 在两个旋转期间，准备/包装柱（要在冷藏室或熟食店冰箱内进行）：
  1. 将1ml浆料Ni-NTA树脂吸入一次性重力流动柱中，并允许液体流过。
  2. 通过在4℃下将10毫升平衡缓冲液通过柱平衡Ni-NTA树脂
  3. 一旦大部分缓冲液通过，并且〜2-3毫米的缓冲液保留在树脂顶部。
8. 最终旋转后（步骤D12），将裂解物通过0.22μmPES膜真空过滤器，并将滤液吸入无菌瓶中。
9. 将经过滤的裂解物通过填充的Ni-NTA柱（在步骤D13中制备），并将其通过标示为“裂解液流通”的50ml锥形管中收集。
  注意：如果复合物怀疑已经通过柱而没有结合，则可以在SDS-PAGE上检查裂解物流通是否存在Cas10-Csm复合物。
10. 通过将10ml洗涤1缓冲液通过柱洗涤柱。
11. 收集洗涤1流通到一个15毫升锥形管注意：如果复合体在洗涤期间怀疑已经通过色谱柱，则可以保存并检查洗涤1流通通道。* / em>
12. 通过将10ml洗涤2缓冲液通过色谱柱第二次洗涤。
13. 收集洗涤2流通到一个15毫升锥形管注意：洗涤2流通可能会被保存，并在以后检查Cas10-Csm复合物，以防复合体在洗涤过程中怀疑已经通过色谱柱。
14. 用5-7等分的洗脱缓冲液（每个馏分500μl）从柱洗脱蛋白质。当每个等分试样流经时，将其捕获到新鲜的适当标记的微量离心管中
15. 加入新鲜标记的微量离心管中，将每个级分的20μl与5μl5x蛋白质加载缓冲液结合
16. 在加热块上在95℃热样品5分钟。
17. 将样品与蛋白质标准一起载入12％SDS-PAGE凝胶。
18. 在Tris-glycine-SDS 1x缓冲液中以120V运行凝胶1小时
19. 用考马斯蓝溶液染色凝胶10分钟，用脱色溶液脱色长达40分钟。
20. 在白光下形成凝胶（图4）
21. 在-20°C保存所需的洗脱液（见注2）。
  注意：避免复合物的反复冻融循环，因为这会导致蛋白质聚集。如果需要，将所需的洗脱液等分成较小的体积（〜100μl）。未经重复解冻的蛋白质复合物可以在-20℃下在洗脱缓冲液中储存至一年，而不会明显降解蛋白质或crRNA。
  
  图4.从S纯化后Cas10-Csm复合物的洗脱液。表达的表达 LM1680表达p / Csm2 <6h> 。显示从镍 - 琼脂糖柱收集的七个级分（E1-E7）在12％SDS PAGE凝胶上。蛋白质用考马斯蓝G-250染色。
第5天净化 - 第2部分
1. 将10μlSera-Mag ^{TM磁性链亲和素包被的小珠吸入微量离心管。
  注意：使用前，将珠悬浮液很好地上下移动多次。}
2. 用100μl1x退火缓冲液重新悬浮珠子（参见配方2）。
  注意：一旦溶液变成均匀的棕色，就可以实现珠重新悬浮，并且在管的侧面或底部没有看到珠积聚。当管从磁性架上取出时，其内部的珠可以很容易地重新悬浮。
3. 通过将微量离心管放入磁性分离架中并等待珠子收集在管子的侧面，从而将珠子打碎。
  注意：根据使用的珠子和机架，收集过程可能在30秒到2分钟之间变化。收集过程将在上清液变清晰后完成，并且珠（褐色）在磁铁所在管侧聚集。如果珠子围绕管的一侧广泛分布，将微量离心管顺时针旋转几度，或者在机架内逆时针旋转，以将所有的珠子更靠近在一起。
4. 轻轻移出上清液，不要打扰珠子。
5. 重复洗涤（步骤E2-E4）三次。
6. 收集最浓缩的Cas10-Csm复合物级分（在第4天获得），并与2ng与crRNA反义的5'生物素化寡核苷酸（参见注3）结合。
7. 让混合物在室温下孵育30分钟。
8. 将含有珠的微量离心管从磁性架上取出，并将Cas10-Csm复合物/寡聚混合物加入平衡的链霉亲和素珠中。
9. 重新悬浮珠，直到混合物显得均匀，并使其在室温退火30分钟
10. 通过将微量离心管放回磁架〜30秒，将珠收集在管的侧面
11. 轻轻移出上清液，不要打扰珠子。
12. 从磁性架上取出管，并将珠子悬浮在100μl1x退火缓冲液中
13. 通过将微量离心管放回磁架〜30秒，将珠收集在管的侧面
14. 轻轻移出上清液，不要打扰珠子。
15. 重复洗涤（步骤E12-E14）两次。
16. 向珠中加入20μl1x退火缓冲液，加入5μl5x蛋白加载缓冲液。
17. 将样品在95℃加热块加热5分钟
18. 将管放回磁性架，以从溶液中除去珠子。
19. 将蛋白质标准物上清液加入12％SDS-PAGE凝胶中
20. 在Tris-glycine-SDS 1x缓冲液中以120V运行凝胶1小时
21. 用考马斯蓝溶液染色凝胶10分钟，用脱色溶液脱色长达40分钟。
22. 在白光下形成凝胶（图5）
  
  图5. 表皮霉素用生物素化寡核苷酸进行亲和纯化后，从磁性链亲和素珠中收集Cas10-Csm复合物，使其与反向 crRNAs 蛋白质在12％SDS PAGE凝胶上分离，与考马斯蓝色G250。

数据分析

该测定用作评估Cas10-Csm复合物完整性的定性测量。 SDS-PAGE凝胶上特定蛋白质亚基的存在或不存在将指示其是否与复合物稳定相关。使用该方案，可以通过从第一纯化过程获得的Cas10-Csm复合物等分试样中直接提取crRNA，然后用γ-^{32'进行5'末端标记来确定复合物内crRNA的存在或不存在和长度， / sup> P-ATP，并将其分解在8-12％的聚丙烯酰胺凝胶上。在确定复杂的稳定性之前，这些测定必须在三次独立的重复中给出一致的结果。对于首次表征的复合物，必须使用蛋白质印迹法确认凝胶中每个亚基的身份。这些附加方法在（Hatoum-Aslan等人，2013）中描述）。}

笔记

该方案描述了来自S的Cas10-Csm复合物的纯化。表皮炎 LM1680或 S。金黄色葡萄球菌携带p / / / / / / / / / / / / / / />的RN4220细胞是从S编码整个III-A型CRISPR-Cas系统的质粒。具有引入到csm2的N末端的6x-His标签的表皮细胞RP62a（Hatoum-Aslan等人，2013）。 S上。表皮炎 LM1680是一种衍生物。具有包含CRISPR-Cas基因座（Hatoum-Aslan等人，2013）的染色体缺失的表皮葡萄球菌RP62a。 S上。金黄色葡萄球菌 RN4220是用作克隆中间体的 crispr -strain（Nair等人，2011）。当在p crispr / Csm2 ^{H6N 上重新引入时，CRISPR-cas系统在两个菌株中保留完整的功能。 p crispr / Csm2 ^{H6N 需要在10μg/ ml氯霉素中进行选择。另外，使用15μg/ ml的新霉素专门用于选择S。表皮炎 RP62a或LM1680。该方案也可以适应于在不同质粒或不同菌株中过表达CRISPR-Cas系统，然而，抗生素选择也必须相应地进行修改。如果使用野生型菌株，在理论上过表达编码CRISPR-Cas系统的一个亚基6x-His的质粒，即使在背景系统的染色体拷贝存在的情况下也可以使Cas10-Csm复合物纯化。}}
可以在第一次纯化后进行质谱分析，以检测与复合物松散相关的潜在结合配偶体。此外，复合物中crRNA的存在或不存在及其长度可以通过在第一次纯化后终止标记RNA并在尿素PAGE凝胶上拆分来从复合物中提取RNA来确定。如果需要更清洁的制剂或评估复杂的稳定性，则应进行第5天描述的第二次纯化。
在该实施例中使用的生物素化的寡核苷酸的序列与重复 - 间隔物阵列的第一间隔物（ spc 1 1）互补：
5'-Biotin-TEG-ACGAGAACACGUAUGCCGAAGUAUAUAAAUC

食谱

媒体和抗生素
1. 脑心脏输液（BHI）肉汤
  1. 溶解3.7 g / 100ml dH 2 O - / -
  2. 在121℃高压灭菌30分钟
  3. 在室温下存放
2. 氯霉素储备液（10mg / ml）
  1. 将100mg氯霉素溶解于10ml的100％乙醇中
  2. 通过0.22μm注射器过滤器
  3. 储存于4°C
3. 新霉素原料（15mg / ml）
  1. 将150毫克新霉素溶解于10ml dH 2 O - / -
  2. 通过0.22μm注射器过滤器
  3. 储存于4°C
库存解决方案
1. 1M MgCl 2
  1. 将9.521 g MgCl 2放入100 ml量筒中
  2. 填充dH _{2 O达100 ml}
  3. 在室温下存放在瓶子里
2. 1M Tris-HCl，pH 8.3
  1. 将121.14 g Tris放入1升量筒中
  2. 用800毫升dH 2 O溶液溶解
  3. 用12N HCl将pH调节至8.3
  4. 填充dH _{2 O至1 L}
  5. 在室温下存放在瓶子里
3. 1M Tris-HCl，pH6.8
  1. 将121.14 g Tris放入1升量筒中
  2. 用800毫升dH 2 O溶液溶解
  3. 用12N HCl将pH调节至6.8
  4. 填充dH _{2 O至1 L}
  5. 在室温下存放在瓶子里
4. 1 M KCl
  1. 将7.455克KCl放入100毫升量筒中
  2. 填充dH _{2 O达100 ml}
  3. 在室温下存放在瓶子里
5. 500mM EDTA，pH 8.0
  1. 将93.06g EDTA，二钠盐，二水合物（MW = 372.24g / mol）放入500ml烧杯中
  2. 尽可能多地用350ml dH 2 O - / - 溶解
  3. 用10N NaOH调节pH至8.0，同时不断搅拌注意：ED TA不会完全溶解，除非其pH为8.0。然而，当时，EDTA的pH持续下降。因此，必须使用不断添加10 N NaOH以使EDTA完全溶解，最终pH为8.0。
  4. 填充dH <2> O至500 ml
  5. 在室温下存放在瓶子里
6. 10％十二烷基硫酸钠（SDS）
  1. 将1克SDS放入15毫升锥形管中
  2. 用6ml dH 2 O O溶解
  3. 填充dH <2> O至10 ml
  4. 在室温下存放
    
    由于粉状SDS会引起严重的眼睛和肺部损伤，可购买20％的溶液（VWR Cat。 97062-440），并稀释与dH <2> O（1：1）。
7. 1％溴酚蓝
  1. 将0.1g溴酚蓝放入15 ml锥形管中
  2. 填充dH <2> O至10 ml
  3. 在室温下存放
8. 2mg / ml重组溶葡萄球菌素
  1. 将50mg溶葡萄球菌溶解在25ml NaOAc中，pH4.5
  2. 将0.5ml等分试样分配到微量离心管中
  3. 储存于-80°C
  4. 解冻之前使用
9. 2x裂解缓冲液
  1. 将11.998g NaH 2 PO 4置于1L量筒（[最终] = 100mM）中）/ /
  2. 将35.064g NaCl放入量筒（[最终] = 600mM）
  3. 用dH 2 O填充至800ml
  4. 用10N NaOH调节pH至8.0
  5. 填写1 L
  6. 在室温下存放
10. 5x退火缓冲液
  1. 将2.5毫升1M Tris-HCl，pH 8.3放入100毫升瓶中（[最终] = 25毫米）
  2. 将37.5ml 1M KCl放入瓶中（[最终] = 375mM）
  3. 将1ml 500mM EDTA，pH8.0放入瓶中（[最终] = 5mM）
  4. 加入59毫升dH 2 O - / -
  5. 在室温下储存瓶子
11. 5倍蛋白加载缓冲液
  1. 将0.5ml 1M Tris-HCl，pH 6.8放入15ml锥形管中（[最终] = 62.5mM）
  2. 将0.8ml 100％甘油置入管中（[最终] = 10％）
  3. 将1.6ml 10％SDS溶液放入管中（[最终] = 2％）
  4. 加入0.4ml 14.3Mβ-巯基乙醇（[最终] = 715mM）
  5. 向管中加入0.4ml的1％溴酚蓝（[最终] = 0.05％）
  6. 加入4.3ml的dH 2 O - / -
  7. 将1ml等分试样分配到微量离心管中
  8. 储存于-20°C
12. 考马斯蓝染色溶液
  1. 将1克考马斯蓝G-250放入1升量筒（[最终] = 0.1％）
  2. 将500毫升甲醇放入量筒（[最终] = 50％）
  3. 将100ml乙酸放入量筒（[最终] = 10％）
  4. 将400ml dH 2 O加入量筒（[最终] = 40％）
  5. 在室温下存放在瓶子里
13. 解决问题
  1. 将500毫升甲醇放入1升量筒（[最终] = 50％）
  2. 将100毫升乙酸放入量筒（[最终] = 10％）
  3. 将400ml dH 2 O加入量筒（[最终] = 40％）
  4. 在室温下存放在瓶子里
14. 1×Tris-甘氨酸-SDS缓冲液
  1. 将100毫升10倍Tris-甘氨酸-SDS缓冲液放入1升量筒中
  2. 填充dH _{2 O至1 L}
  3. 在室温下存放在瓶子里
缓冲液在第4天准备净化 - 第1部分
注意：所有以下缓冲区应该新鲜准备。保持缓冲区在冰上。从1升培养物中准备10ml每个细胞沉淀的缓冲液。
1. 洗脱缓冲液（10ml [最终体积]）
  1. 将60mg NaH 2 PO 4置于50ml锥形管中（[最终] = 50mM）
  2. 加入175mg NaCl（[最终] = 300mM）
  3. 加入170mg咪唑（[最终] = 250mM）
  4. 加入1ml甘油（[最终] = 10％）
  5. 加入8 ml dH 2 O - / -
  6. 用10N NaOH调节pH至8.0
  7. 使用dH O
    将最终体积加至10ml
2. 重悬浮缓冲液（10ml [最终体积]）
  1. 将9.2ml 2x裂解缓冲液放入50ml锥形管中
  2. 加入800μl洗脱缓冲液
  3. 加入1个完整的片剂蛋白酶抑制剂（游离EDTA）
  4. 盖管紧紧旋转直到片剂完全溶解（30秒-1分钟）
  5. 加入10μlTriton X-100（[最终] = 0.1％）
  6. 轻轻反转管，直到Triton X-100完全溶解
3. 平衡缓冲液（10ml [终体积]）
  1. 将5 ml 2x裂解缓冲液放入50 ml锥形管中
  2. 加入5ml dH O O
4. 洗1缓冲液（10ml [终体积]）
  1. 将5 ml 2x裂解缓冲液放入50 ml锥形管中
  2. 加入800μl洗脱缓冲液
  3. 加入4.2ml dH 2 O
5. 洗2缓冲液（10ml [最终体积]）
  1. 将5 ml 2x裂解缓冲液放入50 ml锥形管中
  2. 加入800μl洗脱缓冲液
  3. 加入3.2ml dH 2 O O
  4. 加入1ml甘油（[最终] = 10％）