材料和试剂

设备

软件

程序

抽样
将拟南芥种子播种在10厘米盆中的土壤上，并在封闭的橱柜中在16小时光/8小时暗光周期下使用120μmol/平方米的荧光灯生长。 sec ^-1，23±2℃，相对湿度65-70％。对于测量，21日龄的拟南芥植物（即，第三和第四叶）的年轻，完全膨胀和平坦的叶子被收获以立即使用。
注意：

叶印
1. 混合硅氧烷低粘度压印材料（聚硅氧烷）和催化剂/硬化剂，其比例约为1:0.75。在整个叶子被材料覆盖的情况下，混合2厘米的硅低粘度压印材料和1.5厘米的催化剂/硬化剂。使用刮刀混合很好约30秒（图1A）。
2. 使用刮铲和最小压力将混合物立即施加到叶子的背面（图1B和1C）。在23°C时，硬化通常需要4-5分钟。
3. 硬化后，夹住叶片的尖端，并与主叶静脉的方向一起剥离（图1D和1E）。
4. 通过用透明的指甲油薄层覆盖硅胶印记并使其在室温下干燥至少1小时，形成积极的印象（图1F）。
5. 将硅橡胶印象放在玻璃片上，正面印象（表面覆盖有清漆）面朝下。通过轻轻地将硅橡胶压在其上，将薄薄的指甲油转移到玻璃载玻片上（图1G和1H）。
注意：
1. 高温或更高量的催化剂/硬化剂将加速硬化。
3. 硅胶印记可以在室温下长期储存并重新使用
图1. Leaf impression程序
用光学显微镜测量气孔
1. 在光学显微镜下使用60x物镜观察印记，并拍摄放大图像的照片。
2. 使用图像处理软件ImageJ（ http://rsb.info.nih.gov/ij/）。
注意：

由于印记通常不是完全平坦的，所以叶片部分的所有区域都不在焦点。当细胞的边缘清晰锐利时，叶片部分被认为是聚焦的。为了解决这个问题，可以在不同的焦点深度拍摄叶片部分的几张照片。
图2. ImageJ软件的快照，显示气孔长度和宽度的代表性测量。比例尺= 3μm。

数据分析

在典型的硅印记上分析的气孔数量为30-40。这些气孔在相同载玻片的分开的微观领域中随机选择。分析了每条拟南芥10条叶。

使用Excel电子表格软件编译数据并计算所有选定气孔的宽度和长度之间的比例。
使用ANOVA（Sigma Plot软件，版本11.0）对获得的数据进行统计学评估。考虑小于0.05的P 值具有统计学意义。至少进行三次实验。
使用三种叶片的拟南芥加拿大哥伦比亚（Col-0）进行十次测量的例子如表1所示。
注意：哥伦比亚（Col-0）是拟南芥最广泛使用的加拿大国家。

表1.拟南芥Col-0的三叶气孔孔径的测量和计算

注意：其他气孔孔径的结果发表在Scarpeci等，2017年

致谢

这项工作得到阿根廷ANPCyT和CONICET的支持。这个协议是从以前的工作中修改过的（Weyers和Johansen，1985）。

参考

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