材料和试剂

35毫米盘*
60毫米盘*
口吸移液管*
0.22μm过滤器*
Microloader（Eppendorf，目录号：5242956003）
用于吸液管的玻璃毛细管（Drummond Scientific，目录号：1-000-0500）
用于保持移液器的玻璃毛细管（Sutter Instrument，目录号：B100-75-10）
用于注射移液管的玻璃毛细管（World Precision Instruments，目录号：TW100F-4）
雄性和雌性C57BL / 6×DBA / 2杂种（B6D2F1）或其他菌株（用于接受体合子）
男性和女性ICR（用于制备假孕小鼠）
Cas9质粒（可从Addgene获得）
1. Cas9（nCas9）的茜素型（Addgene，目录号：41816）
2. FokI域融合催化无活性（fCas9）（Addgene，目录号：52970）
PrimeSTAR MAX（Takara Bio，目录号：R045A）或其他PCR聚合酶
Qiaquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）或等同物
年龄 I *
mMESSAGE / mMACHINE T7转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM1344）}
MEGAclear转录清除试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM1908）}
怀孕母马血清促性腺激素（PMSG）（ASKA Animal Health，Serotropin ^{，目录号：879412）}
人慢性促性腺激素（hCG）（ASKA Animal Health，目录号：Gonatropin 3000）
透明质酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：H4272）
KSOM媒体（ARK资源）
二氯二甲基硅烷（Tokyo Chemical Industry，目录号：D0358）
ExoSAP-IT（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，目录号：78200.200 UL）}
氯化钠（NaCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
氯化钾（KCl）（Nacalai Tesque，目录号：28514-75）
氯化钙（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2773）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
HEPES（DOJINDO，目录号：342-01375）
DL-乳酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：L7900）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：P2256）
D-（+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7528）
聚乙烯醇（Sigma-Aldrich，目录号：P8136）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
苯酚红（Sigma-Aldrich，目录号：P0290）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich）
石蜡液（Nacalai Tesque，目录号：26137-85）
BIOTAQ（Bioline，目录号：BIO-21040）或其他PCR聚合酶
M2介质（见配方）

*注意：没有特别的偏好。

设备

分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop ND-1000）
毛细管拉拔器（Sutter Instrument，型号：P-1000）
Microforge（NARISHIGE，型号：MF-900）
微型离心机*
热循环仪*
加热块*
立式显微镜*
微操纵器（NARISHIGE，型号：NT-88-V3）
注射器（NARISHIGE，型号：IM-11-2和IM-9B）
FemtoJet（Eppendorf，型号：FemtoJet ^{® Express）}
CO 2培养箱（37℃，5％CO 2和95％空气条件）

*注意：没有特别的偏好。

程序

crRNA设计
1. 为了选择crRNA的靶序列，首先需要可能的sgRNA的列表。我们建议使用在线网络工具，如CRISPR设计工具（ http://crispr.mit.edu / ）或CRISPRdirect（ https://crispr.dbcls.jp/）为此目的。选择一对具有以下标准的sgRNA：间隔距离对于nCas9为4-20个碱基对（bp），对于fCas9为14-19bp（图1），并且该对sgRNA必须位于基因组DNA的相对链上Ran等人，2013; Hara等人，2015）。
2. 通过从一对sgRNA的序列中除去原始相邻基序（PAM）并用U（尿嘧啶）代替T（胸腺嘧啶）来设计crRNA序列，如图1所示。
3. 选择通过HPLC化学合成和纯化的crRNA（42nt）和tracrRNA（69nt）。我们将crRNA和tracrRNA的浓度调整为1μg/μl
  
  图1.修饰的Cas9的crRNA靶位点的设计（顶部）crRNA靶位点在基因组DNA中被加下划线。显示了在Bcr基因的内含子区域的一部分基因组序列的有义链和反义链。（中）crRNA的两个靶位点加下划线。 Protospacer相邻基序（PAM）序列（NGG）以粗体字出现。间隔序列由灰色虚线双头箭头表示。（底部）crRNA序列（42nt）和tracrRNA（69nt）的序列。来自Jinek等人的crRNA特异性序列（22nt）。（2013），显示为蓝色。尿嘧啶显示为红色。
Cas9 mRNA的制备
1. 制备用于体外转录的DNA模板
  1. 使用T7 RNA聚合酶在体外转录反应中合成Cas9 mRNA。注意，含有fCas9的质粒具有T7启动子序列，但是含有nCas9的质粒不是（图2）。为了将T7启动子序列添加到nCas9的5'末端，用以下引物通过PCR扩增nCas9：
    T7-Cas9-F：TAATACGACTCACTATAGGGAGA ATGGACAAGAAGTACTCCATTGG（下划线：T7启动子序列）
    Cas9-R：TCACACCTTCCTCTTCTTC
    通过琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物（4,163bp）
  2. 使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（根据制造商的说明书）纯化PCR产物。纯化产物的浓度可以用分光光度计测定
  3. 将含有fCas9的质粒用“AgeI”消化，并用Qiaquick PCR Purification Kit（根据制造商的说明书）纯化产物。
    
    图2. Cas9 mRNA的制备 Cas9 mRNA合成的示意图。黑线和箭头分别显示骨架载体和引物。巨细胞病毒启动子（pCMV），nCas9和fCas9是盒装的。用绿线描绘T7启动子序列。（左）由于nCas9载体（Addgene＃41816）不含有T7启动子，所以通过使用T7-Cas9-F / Cas9-R引物和质粒作为模板的PCR，将T7启动子加入到nCas9编码序列中。然后将PCR产物进行体外转录反应。（右）fCas9载体（Addgene＃52970）包括T7启动子，其可以通过 I消化在质粒线性化后用于体外转录反应。 >
2. 使用mMESSAGE / mMACHINE T7转录试剂盒（根据制造商的说明书），使用2μgPCR产物或线性化质粒作为模板进行体外转录反应。在TURBO DNA酶处理（包括在mMESSAGE / mMACHINE T7转录试剂盒中）之后，转录的RNA产物用MEGAclear Transcription Clean-Up Kit纯化。我们将mRNA产物的浓度调整为1μg/μl。＆nbsp;
3. 对于显微注射，RNA如下混合：
  1μg/μl的crRNA1和crRNA22.84μl，每个
  1μg/μltracrRNA9.32μl
  1μg/μlnCas9或fCas9 mRNA 7.5μl
  无RNase的水7.5μl
  总体积= 30μl
  注意：
  1. crRNA1，crRNA2，tracrRNA和Cas9 mRNA的最终浓度分别为94.7,94.7,310.7和250ng /μl。
  2. crRNA和tracrRNA的摩尔比在混合物中调整为相等。通过将RNA浓度除以RNA长度计算摩尔比。 crRNA1，crRNA2和tracrRNA的摩尔比分别为94.7 ng /μl/ 42 nt（= 2.25），94.7 ng /μl/ 42 nt（= 2.25）和310.7 ng /μl/ 69 nt（= 4.5） >
  3. 尽管RNA混合物可以在-80℃下储存几个月，但我们建议每次新鲜制备RNA混合物。
收集受精卵
1. 在第1天，通过用5IU PMSG腹膜内注射成年雌性小鼠诱导超排卵。 48小时后（第3天）用5 IU hCG注射雌性小鼠，然后与成年雄性小鼠交叉。
2. 在第4天，牺牲在第3天穿过的雌性小鼠，并从输卵管收集受精卵。为了去除卵丘细胞，在M2培养基（参见食谱）中用0.3mg / ml透明质酸酶处理合子，在37℃下1-5分钟。
3. 使用吸液管选择合子，然后通过KSOM培养基中的移液冲洗数次。
保持和注射移液管的准备
1. 玻璃毛细管用毛细管牵引器拉出。
2. 保持和注射移液器由使用微型锻造的拉出移液器制备。
3. 注射前，以12,000 x g离心RNA混合物10分钟。通过微型加载机将注射移液管装入3-5μlRNA混合物的上清液。
4. 用二氯二甲基硅烷涂覆RNA填充的注射移液管外面。
显微注射
1. 将受精卵放入一滴M2培养基中，并将注射移液管插入受精卵细胞质。将RNA混合物（1-5μl）注入细胞质。注射溶液的量可以使用FemtoJet进行控制。
2. 在M2培养基中灌注注射的卵。用KSOM培养基洗涤受精卵几次。在37°C下降到KSOM下降至第二天。
2细胞胚胎移植
1. 在显微注射的同一天，通过成年ICR女性与输精管切除的雄性小鼠相交获得假孕小鼠（第4天）。
2. 在第5天的早晨，检查ICR女性的阴道塞。如果ICR女性有阴道塞，则认为是假孕
3. 通过在最小体积的KSOM培养基（10-18胚胎）中接种来分离已经达到2细胞阶段的注射的胚胎。将这些胚胎转移到输卵管麻醉，假孕雌性小鼠中
4. 移植后十九天，应获得新生儿。
注意：程序C至程序F是Nagy等人详细描述的胚胎治疗的标准程序。（2003）。
通过PCR直接测序法对创始人小鼠进行基因分型
1. 使用标准程序从尾尖分离基因组DNA（Nagy等人，2003）。
2. 使用围绕crRNA靶序列设计的引物扩增感兴趣的区域，通过用基因组DNA和跨越crRNA靶序列的引物进行PCR。用ExoSAP-IT（或Qiaquick PCR纯化试剂盒）和使用PCR引物的序列处理PCR产物。

数据分析

当通过crRNA / tracrRNA / Cas9杂合引入突变时，将在两个靶位点之间观察到重叠的双峰（参见图3）。如果引入纯合或镶嵌突变，则分别观察到单个或多于两个峰。除了对直接PCR产物进行测序之外，还可以克隆PCR产物并对质粒进行测序。注意，即使在该步骤中的序列中观察到单个峰，也存在镶嵌突变的可能性。建议在可能的情况下，在F 1/2代以及后代中分析突变位点的序列以及任何相关表型。
使用这种方法，根据我们的经验，分别在crRNA / tracrRAN / nCas9和crRNA / tracrRNA / fCas9注射后获得的大约30-40％和30-60％的创始人幼崽分别含有至少一个等位基因的突变（Terao et al。，2016）。

图3.基因分型分析实例从野生型小鼠（上）扩增的PCR产物的电泳图，在单个等位基因（中间）中携带突变的小鼠，以及在两个等位基因中携带突变的小鼠底部）。 crRNA的每个靶位点用实线黑线划线。如果目标网站用虚线加下划线，则表示目标网站被破坏（参见Biallelic突变，底部）。虚线箭头表示突变点。

食谱

M2媒体
94.66 mM NaCl
4.78 mM KCl
1.71mM CaCl 2
1.19mM KH 2 PO 4
1.19mM MgSO 4
4.15mM NaHCO 3
20.85 mM HEPES
23.28mM DL-乳酸钠
0.33mM丙酮酸钠
5.56mM D-（+） - 葡萄糖 0.01％（w / v）聚乙烯醇
0.5％（v / v）青霉素 - 链霉素
0.02％（v / v）酚红
用5-10N NaOH调节pH至7.4 用0.22μm过滤器过滤

致谢

这项工作部分得到了国家儿童健康与发展中心赠款24-3号给S.T.的资助。该协议是根据我们以前在Exp Anim （Terao等人，2016年）中发表的工作开发的。

参考

Cong，L.，Ran，FA，Cox，D.，Lin，S.，Barretto，R.，Habib，N.，Hsu，PD，Wu，X.，Jiang，W.，Marraffini，LA and Zhang，F 。（2013）。使用CRISPR / Cas的多重基因组工程系统。科学 339（6121）：819-823。
Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，JA和Charpentier，E.（2012）。＆nbsp; 可编程双RNA引导的DNA内切核酸酶在适应性细菌免疫中的应用科学 337（6096）：816-821。

Hara，S.，Tamano，M.，Yamashita，S.，Kato，T.，Saito，T.，Sakuma，T.，Yamamoto，T.，Inui，M.and Takada，S。（2015）使用FokI-dCas9通过CRISPR / Cas9系统产生突变体小鼠。 Sci Rep 5：11221.

Mali，P.，Yang，L.，Esvelt，KM，Aach，J.，Guell，M.，DiCarlo，JE，Norville，JE and Church，GM（2013）。＆nbsp; 通过Cas9进行RNA指导的人类基因组工程科学 339（ 6121）：823-826。

Nagy，A.，Gertsenstein，M.，Vintersten，K.和Behringer，R。（2003）。操作小鼠胚胎：实验室手册，第3版冷泉港实验室出版社。

Ran，FA，Hsu，PD，Lin，CY，Gootenberg，JS，Konermann，S.，Trevino，AE，Scott，DA，Inoue，A.，Matoba，S.，Zhang，Y.and Zhang，）。 RNA引导CRISPR Cas9的双切口增强基因组编辑特异性。细胞 154（6）：1380-1389。

Terao，M.，Tamano，M.，Hara，S.，Kato，T.，Kinoshita，M.and Takada，S。（2016）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26972821“target =”_ blank“>使用CRISPR / Cas9系统，利用具有Cas9切口酶和FokI-dCas9的crRNA / tracrRNA有效生产突变小鼠。 Exp Anim 65（3）：275-283。