材料和试剂

PD-10脱盐柱（GE Healthcare，目录号：17085101）
2 ml Eppendorf管
石英显微镜滑动1"x 3"x 1 mm厚，每端都钻有一个小直径的孔（ http://finkenbeiner.com/quartzslides.php ）
显微镜盖板22 x 40-1（Fisher Scientific，目录号：12-545-C）
双面胶带（苏格兰，3M）
移液器尖端
100 kDa MWCO vivaspin 2浓缩器聚醚砜（PES）膜（Sartorius，目录号：VS1041）
Cy3马来酰亚胺，单活性染料（GE Healthcare，目录号：PA13131）
噻吗洛尔马来酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：T6394）
cOmplete ^TM，Mini，EDTA-free蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
Talon金属亲和树脂（Takara Bio，目录号：635502）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I5513）
DMSO（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：D12345）}
SDS-PAGE凝胶（Invitrogen NuPAGE Bis-Tris预制凝胶）
纯化的膜支架蛋白1（MSP1），表达于E。（Ritchie等人，2009）
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（POPC）（Avanti Lipids Polar，目录号：850457P）
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸（POPS）（Avanti Lipids Polar，目录号：840034P）
16：0生物素基帽PE（Avanti Lipids Polar，目录号：870277P）
生物珠SM-2树脂（Bio-Rad Laboratories，目录号：1523920）
Ni-NTA树脂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：88222）}
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G6279）
油脂（Borer Chemie，目录号：glisseal N）
中性粒细胞（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：31000）
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氯化镁（MgCl 2）（无水）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
乙二胺四乙酸（EDTA）（0.5M溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：03690）
N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）（Anatrace，目录号：D310）
胆固醇半琥珀酸盐（CHS）（Sigma-Aldrich，目录号：C6512）
ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A26209）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Fisher Scientific，目录号：70-011-044）
Trolox（Acros Organics，目录号：218940050）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：158968）
葡萄糖氧化酶（Sigma-Aldrich，目录号：G2133）
过氧化氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：C3155）
低盐洗涤缓冲液（见配方）
高盐洗涤缓冲液（见配方）
溶解缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液1（参见食谱）
洗涤缓冲液2（参见食谱）
标签缓冲液（见配方）
SEC洗脱缓冲液（见配方）
IMAC洗脱缓冲液（见配方）
最终缓冲（见配方）
成像缓冲区（请参阅配方）

设备

100毫升玻璃组织匀浆器（Sigma-Aldrich，目录号：T2567）
贝克曼超离心机
Ti45转子（Beckman Coulter，型号：45 Ti，目录号：339160）
Ti70转子（Beckman Coulter，型号：70 Ti，目录号：337922）
Beckman X-12R离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-12R）或等效物
AKTAxpress FPLC系统（GE Healthcare，型号：AKTAxpress）
Superdex 200增加100/300尺寸排除列（GE Healthcare，目录号：17517501）
色谱柱填充1-2ml Ni-NTA琼脂糖珠（以下称为Ni柱）
Axiovert 200显微镜（Carl Zeiss，型号：Axiovert 200）或等效物
水浸式C-Apochromat 63x/1.2W物镜（Carl Zeiss，型号：C-Apochromat 63x/1.2W Corr）或等效物
电荷耦合器件（EMCCD）摄像头（Andor Technology，型号：DU-897E iXon + EMCCD）或等效物
532nm（绿色）激光（CrystaLaser，目录号：CL532-050-S）或等效物

软件

数据采集软件（可从 https://cplc.illinois.edu/software/）
MATLAB脚本
Igor软件

程序

本文描述的方案是针对含有热稳定性E122W突变的β2肾上腺素能受体（β2亚型AR）构建体开发的（Roth等，2008），C-残基348处的末端截短，第三细胞内环（ICL3）中残基245至259的缺失，N-末端的FLAG标签和C末端的10x His标签。该构建体还含有C327S和C341S突变，仅留下单个反应性半胱氨酸残基（Cys265）用于荧光标记。缺失，截短和半胱氨酸突变不会破坏配体与受体的结合（Liu et al。，2012）。在高滴度重组病毒感染的sf9昆虫细胞中表达受体的程序在其他地方描述（Cherezov等人，2008）。

受体纯化和Cy3标记
1. 使用100ml玻璃组织匀浆器洗涤冷冻的β2亚型AR生物量（5L，约0.5mg受体/1L生物质）。细胞裂解主要通过使用高渗（低盐）缓冲液和均质化的机械力来实现。用低盐洗涤缓冲液和高盐洗涤缓冲液分别洗涤溶解的生物质3次（每次洗涤500ml）。使用Beckman Ultra离心机将膜片段悬浮液（158,000 x g，Ti45转子，35分钟，4℃）沉淀在洗涤液中。洗涤的膜可以在-80℃下储存长达两周或4℃过夜。理想情况下，洗涤的膜应该被等分，使得每个等分试样的膜含有大约0.5-1mg的最终纯化的受体。
2. 用1mM噻吗洛尔（溶于ddH 2 O），1份破碎的Roche蛋白酶抑制剂片剂在4℃下处理一份洗涤的膜。该步骤可以通过加入预先制备的100mM噻吗洛尔原液（4℃储存）并将Roche抑制剂直接压碎至悬浮膜来完成。然后，将处理过的膜与增溶缓冲液以4:1的比例以1:1的比例充分混合3小时
3. 使用Beckman Ultra离心机（转子Ti70），以265,000 x g，35分钟，4℃从上清液中除去膜沉淀。向上清液中加入5M NaCl，4M咪唑，使最终浓度为800mM NaCl，20mM咪唑。加入0.5毫升洗涤的塔隆浆液至上清液，并在4℃下孵育过夜。
4. 使用Beckman X-12R离心机（或等同物），500×g，1分钟，4℃的粒状爪骨树脂，并除去上清液。用50ml洗涤缓冲液1,10ml洗涤缓冲液2,10ml标记缓冲液洗涤。在沉淀树脂的顶部加入5ml标记缓冲液，加入20μl5mg/ml（在DMSO中）Cy3原液（终浓度约为25μM，而受体浓度约为1-5μM）。在黑暗中4℃孵育2小时。
5. 将塔隆树脂加载到空的柱子上，用50ml洗涤缓冲液2用重力流洗涤。用1ml洗脱缓冲液洗脱纯化的标记受体。运行SDS-PAGE以显示洗脱模式。使用100 kDa的MWCO vivaspin2浓缩器浓缩Cy3标记的受体
Nanodisc准备
1. 将混合标记的受体，纯化的MSP1和磷脂混合物以1：10：700的摩尔比混合在2ml Eppendorf管中。磷脂混合物含有POPC，POPS和生物素类Cap PE，比例分别为67.5％，27.5％，5％。加入生物珠树脂，并在4℃下孵育过夜。
2. 通过造粒去除生物珠树脂。通过使用AKTAxpress FPLC系统的尺寸排阻色谱法纯化纳米圆盘，superdex 200增加100/300 GL柱和SEC洗脱缓冲液。膜蛋白 - 纳米复合物的代表性洗脱曲线在其他地方（Ritchie等人，2009）提出。通过使用AKTAxpress FPLC系统，Ni柱和IMAC洗脱缓冲液的固定化金属亲和层析（IMAC）去除空的纳米圆盘。使用PD-10脱盐柱（GE Healthcare）向最终缓冲液交换缓冲液。
  注意：Ni-NTA和talon（Co ^{2 +} ）树脂都用于用聚组氨酸标签纯化受体蛋白，但不同之处在于1）Ni 2 + 对组氨酸具有更大的亲和力，赋予每ml树脂更大的结合能力，而2） Co ^{2 +} 对组氨酸具有更大的选择性。因为如上述步骤A3中所述，优选将这种爪子树脂用于粗裂解物，而Ni-NTA优选用于本文所述的最终纯化步骤。
受体 - 纳米复合体的表面固定
1. 如前所述（Lamichhane等人，2010），清洁石英滑块和盖玻片，用聚乙二醇（5％生物素化）钝化表面。
2. 使用双面胶带在石英玻片上制备约4-5毫米宽的微流体通道，将盖子滑动到双面胶带的顶部，并在实验时使用硅油封闭通道的两端（图2）。该装置随后称为样品室。
  
  图2.微流体样品室的图示。如图所示，缓冲液或样品溶液通过进样口通过移液管吸头引入。任何多余的溶液流出出口，如图所示
3. 向样品室中加入0.2mg/ml中性抗生物素蛋白，孵育5分钟，最后缓冲液洗涤
4. 向样品室填充100μl受体 - 纳米圆盘复合物（约1 nM浓度），孵育10 min，使复合物（含有5％生物素化脂质）与表面上的中性抗生物素蛋白结合，然后用成像缓冲液冲洗腔室。
单分子荧光数据采集
1. 具有全内反射荧光（TIRF）测量的显微镜，其具有用于激发的532nm（绿色）激光（基于棱镜或基于物体的照明））和能够检测荧光发射的强化电荷耦合器件（CCD）照相机来自单荧光团（Berezhna等人，2012）用于以规则的时间间隔（例如，每100毫秒或更短）记录表面的TIRF图像，依赖于在CCD摄像机的帧时间上）总共至少100秒。许多离散的荧光斑点在图像中应该是可见的，每一个都代表着单独的受体 - 纳米圆盘复合体（图3A）
2. 向样品室中加入配体如激动剂福莫特罗或反向激动剂ICI 118,551（1 mM），使配体与受体（30分钟至1小时）相互作用并重复数据采集。或者，准备一个含有受体 - 纳米复合物和配体的预孵育混合物的新样品室
3. 作为测试非特异性结合的对照，将受体 - 纳米复合物添加到缺乏中性抗体的表面。在表面上应该看得很少的荧光斑点（图3B）。
  
  图3.固定的受体 - 纳米圆盘复合物的TIRF图像和单个受体 - 纳米圆盘复合物的代表性时间曲线（从Lamichhane等人，2015年转载）。显示在纳米圆盘中重构的固定化的Cy3标记的β2亚型的5×5μm区域（近似尺寸）的典型TIRF图像。每个点都是由于单个受体 - 纳米圆盘复合体发出的荧光。非常亮点是由于受体 - 纳米尺度聚集体的一小部分，容易被识别并排除在数据分析之外。 B.对照表面缺乏嗜中性粒细胞的相应TIRF图像。相对于部分A，荧光斑点的数量大大降低，表明受体 - 纳米复合物的非特异性吸附水平可以忽略不计。 C.代表荧光强度对来自单个纳米盘结合受体的时间曲线，显示在不可逆的漂白事件之前的重复的两态强度跳跃。红线是隐马尔可夫模型中最适合的。单步光漂白转移证实纳米圆盘中含有单一受体分子

数据分析

使用数据采集软件（可从 https://cplc.illinois.edu/software/获取）），以获取每个时间点上每个识别点的发射强度。
过滤数据以排除：（a）显示非常高的发射强度，指示受体 - 纳米体聚集体，或（b）显示光致连接跃迁（发射强度瞬时采样零强度状态）。对于后续分析，选择显示单步光漂白转换的时间曲线，指示单个受体分子（图3B）。
对于每个选定的时间轨迹，在单次漂白过渡后建立背景强度水平。相应地纠正所有以前时间点的强度。步骤2和3（数据分析）可以使用合适的MATLAB脚本进行自动化。
大多数选定的时间轨迹应显示两个不同强度水平之间的可逆转换（图3C）。使用至少100条迹线，构建表示在整个集合中采样的强度状态的二进制强度直方图（使用Igor软件）。直方图通常显示两个不同的峰。使用两个高斯函数拟合直方图，以确定每个峰值的中心和相对面积（使用Igor或Origin软件）。
对激动剂或反向激动剂配体存在下获得的数据重复此分析。在激动剂的存在下，代表受体活性状态的强度峰将被增强，而在反向激动剂的存在下，代表无活性状态的峰将被增强，从而建立两个峰的身份。峰值区域报告受体的无活性和活性构象状态的平衡分布
使用隐马尔可夫分析（McKinney等人，2006）来适应每个所选择的强度轨迹，以确定在转换到另一状态之前在每个状态中花费的停留时间（图3C所示的拟合示例）。从整个复合体集合构建每个状态的停留时间的直方图。使用单指数衰减函数拟合直方图以确定激活或停用转换的速率常数（使用Igor软件）。如果单指数拟合差，则基于减少的卡方值，使用双指数函数重新设计直方图（Lamichhane等人，2015）。

食谱

低盐洗涤缓冲液
10mM HEPES，pH = 7.5,20℃ 10mM MgCl 2
20 mM KCl
2 mM EDTA
高盐洗涤缓冲液
10mM HEPES，pH = 7.5,20℃ 10mM MgCl 2
20 mM KCl
1 M NaCl
溶解缓冲液
100mM HEPES，pH = 7.5,20℃ 300 mM NaCl
1％（w/v）DDM，0.2％CHS（w/v）
洗涤缓冲液1
50mM HEPES，pH = 7.5,20℃ 800 mM NaCl
10mM MgCl 2
20mM咪唑
0.05％（w/v）DDM，0.01％（w/v）CHS
8 mM ATP
洗涤缓冲液2
50mM HEPES，pH = 7.5,20℃ 150 mM NaCl
20mM咪唑
0.05％（w/v）DDM，0.01％（w/v）CHS
标签缓冲区
50mM HEPES，pH = 7.5,20℃ 150 mM NaCl
0.05％（w/v）DDM，0.01％（w/v）CHS
GPCR配体
SEC洗脱缓冲液
50mM PBS，pH = 7.4,20℃
IMAC洗脱缓冲液
50mM HEPES，pH = 7.5,20℃ 150 mM NaCl
200毫克咪唑
0.05％（w/v）DDM，0.01％（w/v）CHS
最终缓冲区
50mM HEPES，pH = 7.5,20℃ 150 mM NaCl
成像缓冲液（最终缓冲液加除氧清除系统）
50mM HEPES，pH = 7.5,20℃ 150 mM NaCl
2 mM trolox
2-5％（w/v）葡萄糖
50μg/ml葡萄糖氧化酶
10μg/ml过氧化氢酶

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院路线图倡议拨款P50 GM073197的支持。这里描述的协议改编自Lamichhane等人的工作。（2015年）。

参考

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