材料和试剂

无菌方形（120×120×17mm）培养皿（Greiner Bio One International，目录号：688161;由VWR提供）
无菌1μl接种环（SARSTEDT，目录号：86.1567.010）
无菌1.5 ml Eppendorf管3810X（Eppendorf，目录号：0030125150）
无菌μ盘35毫米高玻璃底（ibidi，目录号：81158）
显微镜盖玻片20 x 20毫米（Carl Roth，目录号：H873）
无菌注射器50ml（SARSTEDT，目录号：94.6077.137）
无菌注射器过滤器Filtropur S 0.2（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
无菌50ml格林纳离心管（Greiner Bio One International，目录号：227261）
血清移液管25毫升（SARSTEDT，目录号：86.1685.020）
血清移液管5ml（SARSTEDT，目录号：86.1253.025）
集胞藻 sp。 PCC 6803菌株（由S.Shestakov，Moscow State University，Russia获得的活性野生型），由Trautmann等人（2012）
重新排序。
液体石蜡，粘稠（Carl Roth，目录号：8904）
超纯水
乙二胺四乙酸二钠盐脱水（Na 2 EDTA·2H 2 O）（Carl Roth，目录号：8043）
氢氧化钠（NaOH）（Carl Roth，目录号：6771）
磷酸氢二氢钾三水合物（K 2 HPO 4·3H 2 O）（EMDMicipore，目录号：105099） >
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Carl Roth，目录号：P028）
硼酸（H 3 3 BO 3）（Carl Roth，目录号：6943）
氯化锰（II）四水合物（MnCl 2·4H 2 O）（Carl Roth，目录号：T881）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Carl Roth，目录号：T884）
钼酸钠脱水（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（Carl Roth，目录号：0274）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（Carl Roth，目录号：P024）
硝酸钴（II）六水合物Co（NO 3 3）2·6H 2 O（Carl Roth，目录号：HN16） >
柠檬酸铵（Carl Roth，目录号：CN77）
2 - [（2-羟基-1,1-双（羟甲基）乙基）氨基]乙磺酸（TES）（Carl Roth，目录号：9137）
硫代硫酸钠（Na 2 S 2 O 3 O 3）（Carl Roth，目录号：HN25）
D（+） - 葡萄糖（Carl Roth，目录号：X997）
硝酸钠（NaNO 3）（Carl Roth，目录号：A136）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Carl Roth，目录号：P027）
氯化钙脱水（CaCl 2·2H 2 O）（Carl Roth，目录号：5239）
柠檬酸（Carl Roth，目录号：X863）
琼脂，神户一（Carl Roth，目录号：5210）
UltraPure ^{TM琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：16500500）}}
0.5 M Na 2 EDTA pH 8.0（参见食谱）
3％w / v K 2 HPO 4·3H 2 O溶液（参见食谱）
2％w / v Na 2 CO 3溶液（参见食谱）
痕量金属混合溶液（见配方）
0.6％w / v柠檬酸铁铵溶液（参见食谱）
1 M TES缓冲液pH 8.0（见配方）
30％w / v Na 2 S 2 O 3 O 3溶液（参见食谱）
40％w / v D（+） - 葡萄糖溶液（参见食谱）
100x BG11培养基（参见食谱）
2x BG11培养基（见食谱）
1x BG11培养基（见食谱）
1％w / v琼脂溶液（见配方）
0.6％w / v琼脂糖溶液（参见食谱）
宏观光趋向板培养基（见食谱）
微观光轴平板培养基（见食谱）

设备
1. 实验室瓶1000毫升（杜兰集团，目录号：21 801 54 5）
2. 实验室瓶500毫升（杜兰集团，目录号：21 801 44 5）
3. 实验室瓶250毫升（杜兰集团，目录号：21 801 36 5）
4. 实验室瓶100毫升（杜兰集团，目录号：21 801 24 5）
5. 不透明方箱（127 x 127 x 19毫米），单面开口（由聚氯乙烯定制）
6. 硅环（øø>：：øøø：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：））））））））））））
7. 不透明中空圆柱体（ø：40 mm，h：30 mm），带有4个孔（ø：5 mm，h：7 mm），以90°为增量，用于插入LED（由聚氯乙烯定制） br />
8. 平衡（丹佛仪器）
9. pH计（Mettler-Toledo）
10. UV / Vis分光光度计（Shimadzu，型号：UV-2401PC）
11. 光源（Philips Lighting Holding，型号：MASTER TL-D Super 80 18W / 840 1SL / 25）
12. 移液辅助剂PIPETBOY acu 2（INTEGRA Biosciences，型号：PIPETBOY acu 2，目录号：155 017）
13. 量子传感器LI-190R（LI-COR，型号：LI-190R）
14. 传输光扫描仪（爱普生，型号：Epson Perfection V700照片，带可调盖）
15. 荧光显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse Ni-U，CFI Plan Fluor 40X / 0.75）
16. 数码CCD相机（Hamamatsu Photonics，型号：ORCA ^{® -05G）}
17. 微控制器板（Arduino，型号：Arduino UNO R3）
18. RGB-LED（625nm，525nm，470nm）5mm（世界贸易网）
19. 生物安全柜（NuAire，型号：Class II Type A2）
  
  软件
  1. NIS-Elements基础研究4.20.01
  2. Arduino 1.0.6
  3. MATLAB Runtime 8.3
  4. BacteriaMobilityQuant（ https：//web.fe.up .pt /〜dee11017 / software / BacterialMobilityQuant.zip ）
  5. R
    
    程序
    1. 宏观光滴测定（图1）
      
      图1.宏观光滴测定。如步骤A1-A8中所述的连续步骤。
      1. 准备80毫升的宏观光轴平台培养基（见食谱）
      2. 混合非常轻轻地避免任何气泡。
      3. 将培养基小心地倒入正方形陪替氏培养皿中并关闭盖子，以避免过度干燥光感受板。让它在平滑的表面凝固。板材应该总是准备好。
      4. 用新鲜生长的琼脂平板或宏观光感受态板（见附注5）从无菌的1μl接种环中刮掉蓝细菌细胞，并将其在50μl1x BG11培养基（参见食谱）中悬浮于无菌的1.5ml Eppendorf管中，通过剧烈扭转环（大约OD 750或非常深绿色）。
      5. 将光趋势板放置在模板上，三个等距间隔的平行排在板的表面区域上。将5μl细胞悬浮液每一列重复一次。关闭盖子，让液滴浸入板中。该步骤可能需要长达一小时，具体取决于板的表面和细胞的密度。
      6. 将光倾斜板倒置在带有单面开口的不透明的方形盒中。将光照板的行平行于开口对齐。
      7. 在约35μmol光子下以30°C的单向白光源以约45°（例如，Philips MASTER TL-D Super 80 18W / 840 1SL / 25）的角度孵育光趋向板使用量子传感器在光趋向盒的前侧测量的m ^{-2 sec ^{-1 。}}
      8. 1-2天后，可以通过扫描板或拍摄照片来记录运动细胞的手指状突起（图2）。对于重复性，所有结果应在同一时间后记录。
        
        图2.宏观光趋向板在A）在琼脂，神户I和B上孵育一天后，运动性野生型细胞的手指状突起在标准Bacto ^{TM 琼脂在单向白光（35μmol光子m ^{-2 ^{sec ^{-1 ）。}}}}
      9. 显微光度测定（图3）
        
        图3.微观光趋化测定。如步骤B1-B12所述的连续步骤。
        
        准备50毫升微观光趋向板培养基（见食谱）。
        
        使用吸液辅助剂轻轻混合，以避免任何气泡。
        
        将5 ml的培养基小心倒入每个无菌玻璃底部μ碟中。使用移液辅助剂并关闭盖子，以避免过度干燥光致变色板。让介质在水平面上凝固，以防止凹凸不平。如上所述，应始终做好新鲜准备
        
        用无菌的1μl接种环路从新鲜的宏观光滑板上刮下运动性蓝细菌细胞，并通过大力扭转环路（大约OD 750）重新悬浮于无菌的1.5ml Eppendorf管中的110μl1x BG11培养基（参见食谱） sub> 1.0或非常浅绿色）。小心不要从表面刮掉任何琼脂。细胞的密度对于实验的结果是至关重要的。如果密度太低，细胞将不能正常移动。如果密度太高，细胞会相互阻碍，跟踪将受到不利影响
        
        将5×2微升的细胞悬浮液滴在每个板的中心，并干燥10-15分钟。避免过度干燥和暴露于强光（例如，，台灯上的阳光）。
        
        所有液体浸入后，请小心地将盖玻片放在细胞顶部。避免气泡，但不要用力按压。如果盖玻片施加得太早或受力压下，细胞将浮起来，主要会观察到布朗运动。如果盖玻片应用太晚，表面的过度干燥将阻碍细胞运动。
        
        用液体石蜡润滑硅环的一面，并将环放在板上。该环应覆盖所有暴露的琼脂糖表面，以最小化蒸发，并防止样品在成像时发生抖动。注意不要用液体石蜡污染盖玻片的表面。
        
        在黑暗环境中孵育样品2-3小时。
        
        将光趋向板放在装有40x物镜的立式显微镜的平台上，并用不透明的中空圆柱盖住，四个孔以90°的增量放置。将LED插入孔中，并将引脚水平对准舞台。确保LED触摸板的中心并聚焦在单元格上。 LED位于与琼脂糖表面相同的高度。
        
        启动显微镜软件NIS-Elements Basic Research 4.20.01。减去显微镜的聚光灯，使其几乎看不到。通常，显微镜软件中显示的直方图应在采集时间的下限范围内> 100毫秒如果冷凝器光的强度太高，则细胞将显示有限的方向运动。如果聚光灯的强度太低，跟踪将受到不利影响
        
        使用微控制器板（例如，Arduino UNO R3，使用软件Arduino 1.0.6）根据需要打开RGB-LED。对于来自RGB-LED（470/525/625nm，等强度）的定向白光照射，总强度为10μmol光子m ^{sec ^{-1 < sup>，用量子传感器测量。}}
        
        根据需要获取图像。对于标准的5分钟时间流逝视频，使用在200msec的采集时间每3秒1帧的帧速率（视频1）。
      数据分析
      1. 将您的数据导入BacteriaMobilityQuant软件。在参数→更新选项卡中调整采集时间和比例等设置。运行程序。在实际跟踪单元格之前，为每个帧（图4A）单独检测单元格的轮廓（图4B）。
        注意：BacteriaMobilityQuant需要在PC上安装MATLAB Runtime 8.3。
      2. 该程序返回两个包含单元格跟踪信息的.txt文件。轨迹显示在.png文件中（图4C），跟踪的单元格的影片将以.avi格式保存（视频2）。
      3. 可以使用软件R执行原始轨迹的数据分析。建议使用某种形式的数据清理来从数据集中丢弃不相关的轨迹（图4D）。为了避免由于跟踪算法在帧之间的单元可能的不匹配造成的伪像，我们只考虑可以跟踪至少25个连续帧的单元，平均速度低于0.4μmsec ^{-1，并且最大位移在两帧之间小于8μm（3秒）。此外，对于跟踪，我们以平均速度低于0.05μmsec ^{-1的方式丢弃不动细胞的亚组。最佳值取决于整体单元速度和帧速率，应仔细评估。如果需要，可以使用R中实现的CIRCULAR软件包（Agostinelli和Lund，2013）执行诸如均匀性瑞利测试之类的数据的方向统计。
        
        图4.来自右侧的10μmol光子m ^{-2 sec ^{-1 的野生型细胞的细菌迁移量定量分析A.细菌迁移量细胞检测; B.细菌迁移量细菌迁移量细胞轨迹; D.用R清除数据，清除不可靠的轨迹和不动细胞。}}}}
      笔记
      1. 所有溶液都是使用超纯水（25℃下的电阻率>18.18MΩcm）和分析级试剂制备的。
      2. 1％w / v琼脂溶液和0.6％w / v琼脂糖溶液应在每次光滴测定之前新鲜制备。
      3. 为了重现性，强烈建议将琼脂，神户I用于宏观光轴平板和UltraPure ^{TM 琼脂糖用于显微光轴向平板。在我们组中，当从标准的Bacto ^{TM 琼脂转变为琼脂，神户I（图2）时，观察到运动性显着增加。}}
      4. 为了重现性，应在板中使用Na 2 O 3 O 3 O 3（Thiel等人，1989））（见配方），所有结果应在同一时间后记录。
      5. 对于宏观光趋化测定，当我们从新鲜生长的琼脂平板上取出细胞并在单向白光下将它们在光感受板上孵育三天时，我们获得最佳结果。细胞的前线现在可以用于实际的光趋化测定。
      6. 在琼脂糖板上点样细胞约2-3小时后进行微观光照测定，并使其在黑暗环境中调整至表面。在这个运动阶段，细胞表现出朝向定向光源的强烈的偏向移动
      7. 对于微观光趋化测定，如果协议相应调整，也可以使用倒置显微镜
      8. 在微观光趋化测定期间，注意板和盖玻片之间可能的气泡的取向。不要在光源和细菌之间放置气泡，以防止散射
      9. 微观光照测定在室温（约22℃）下进行
      10. 必须在生物安全柜中进行涉及处理蓝细菌细胞培养物的每个实验步骤，以防止污染
      食谱
      1. 0.5M Na 2 EDTA，pH 8.0（1,000ml） 186.12g Na 2 EDTA·2H 2 O 加入800毫升ddH 2 O - / - 用NaOH调节至pH 8.0 注意：只有当溶液的pH调节至8.0时，才能使用高浓度的NaOH，钠溶解。 >
        将ddH _{2 O添加到1,000 ml
        高压灭菌并在室温下储存}
      2. 3％w / v K 2 HPO 4·3H 2 O溶液（50ml）
        1.5g K 2 HPO 4 / 3H 2 O
        将ddH _{2 O添加到50 ml
        使用注射器和过滤器过滤灭菌
        储存于4°C}
      3. 2％w / v Na 2 CO 3溶液（50ml）
        1.0g Na 2 CO 3
        将ddH _{2 O添加到50 ml
        使用注射器和过滤器过滤灭菌
        储存于4°C}
      4. 痕量金属混合溶液（500 ml）
        400毫升ddH 2 O O
        1.43g H 3 3 3
        900mg MnCl 2·4H 2 O ○
        110mg ZnSO 4·7H 2 O
        195mg Na 2 MoO 4·2H 2 O 39.5mg CuSO 4·5H 2 O
        24.7mg Co（NO 3 3）2·6H 2 O
        将ddH _{2 O加入500 ml
        使用注射器和过滤器过滤灭菌
        储存于4°C}
      5. 0.6％w / v柠檬酸铁铵溶液（50ml）
        300毫克柠檬酸铵柠檬酸铵将ddH _{2 O添加到50 ml
        使用注射器和过滤器过滤灭菌
        储存于4°C}
      6. 1 M TES缓冲液pH 8.0（50ml）
        30毫升ddH 2 O - / - 11.45g 2 - [（2-羟基-1,1-双（羟甲基）乙基）氨基]乙磺酸（TES）
        用NaOH调节至pH 8.0 将ddH _{2 O添加到50 ml
        使用注射器和过滤器过滤灭菌
        储存于4°C}
      7. 30％w / v Na 2 S 2 O 3 O 3溶液（50ml）
        15g Na 2 S 2 O 3＆lt; 3＆gt;
        将ddH _{2 O添加到50 ml
        使用注射器和过滤器过滤灭菌
        储存于4°C}
      8. 40％w / v D（+） - 葡萄糖溶液（50ml）
        20克D（+） - 葡萄糖
        将ddH _{2 O添加到50 ml
        使用注射器和过滤器过滤灭菌
        在1.5ml Eppendorf管中分装，并在4°C下储存}
      9. 100x BG11培养基（500 ml）
        74.79g NaNO 3
        3.75g MgSO 4·7H 2 O·
        1.80g CaCl 2·2H 2 O O
        0.30克柠檬酸
        0.28ml 0.5M Na 2 EDTA pH8.0
        将ddH _{2 O加入500 ml
        高压灭菌并储存在4°C}
      10. 2x BG11培养基（1,000ml）
        900毫升ddH 2 O - / - 20 ml 100x BG11培养基 2ml 3％w / v K 2 HPO 4·3H 2 O溶液
        2ml 2％w / v Na 2 CO 3溶液
        2ml痕量金属混合液
        将ddH _{2 O添加到998ml
        高压灭菌器
        2ml 0.6％w / v柠檬酸铁铵溶液
        在室温下存放}
      11. 1x BG11培养基（1,000ml）
        900毫升ddH 2 O - / - 10 ml 100x BG11培养基 10ml 1 M TES缓冲液pH 8.0
        1ml 3％w / v K 2 HPO 4·3H 2 O溶液
        1ml 2％w / v Na 2 CO 3 溶液
        1毫升痕量金属混合溶液
        将ddH _{2 O添加到999 ml
        高压灭菌器
        1ml 0.6％w / v柠檬酸铁铵溶液
        在室温下存放}
      12. 1％w / v琼脂溶液（200 ml） 2克琼脂，神户我
        将ddH _{2 O加入200 ml
        高压灭菌和新鲜使用}
      13. 0.6％w / v琼脂糖溶液（100ml）
        0.6g UltraPure ^{TM 琼脂糖
        将ddH _{2 O添加到100 ml
        高压灭菌和新鲜使用}}
      14. 宏观光滑板培养基（80 ml）
        0.8 ml 1 M TES缓冲液pH 8.0
        0.8ml 30％w / v Na 2 S 2 O 3溶液
        0.4ml 40％w / v D（+） - 葡萄糖溶液
        39 ml 2x BG11培养基
        39 ml熔融1％w / v琼脂溶液
        混合和倾倒非常轻轻地避免任何气泡和表面的不均匀性
        避免干燥板
      15. 显微光滑片培养基（50ml）
        0.5 ml 1 M TES缓冲液pH 8.0
        0.5ml 30％w / v Na 2 S 2 O 3 O 3溶液
        0.25 ml 40％w / v D（+） - 葡萄糖溶液
        24.375毫升2x BG11培养基
        24.375ml熔融的0.6％w / v琼脂糖溶液
        使用移液辅助剂轻轻混合和倾倒，以避免任何气泡和表面不均匀避免干燥板
      致谢
      
      该协议基于Schuergers等人（2016）和Schuergers等人（2015）中描述的方法。用于细胞追踪的BacteriaMobilityQuant软件由Tiago Esteves和Maja Temerinac-Ott（Schuergers等人，2016年）开发。 BG11培养基根据Rippka等人制备（1979）。这项工作由德国研究基金会（GSC-4，Spemann研究生院）的卓越计划资助。
      
      参考