材料和试剂

6厘米组织培养处理的培养皿（几种分配器，例如，可康奈治，马萨诸塞州，Tewksbury）
GB 100-F8P硼硅玻璃毛细管（Science Products GmbH，Hofheim，Germany）
注射器（1 ml）
脊髓针（0.5mm，25G）
反应管
感兴趣的细胞系或原代细胞制备
pcDNA ^{TM / / sup> 3.1 / Zeo（+）}
HistoGreen HRP-subtrate试剂盒（Linaris，目录号：E109）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
神经生物素（Vector Labaratories，目录号：SP-1120）
罗丹明B异硫氰酸酯 - 葡聚糖（Sigma-Aldrich，目录号：R9379）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
氯化锂（LiCl）（Sigma-Aldrich，目录号：L9650）
50％戊二醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：340855）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
抗生物素蛋白D偶联辣根过氧化物酶（Vector Labaratories，目录号：A-2004）
PBS（见配方）
神经生物素/罗丹明B异硫氰酸酯 - 葡聚糖溶液（参见食谱）
LiCl溶液（参见食谱）
0.5％戊二醛溶液（见配方）
Triton X-100溶液（参见食谱）
抗生物素蛋白D偶联辣根过氧化物酶溶液（参见食谱）

设备

适用于具有AgCl电极的1mm玻璃毛细管的微电极支架（例如，World Precision Instruments，型号：MEH8）
双微电泳电流发生器SYS-260（世界精密仪器，FL）
蔡司IM35倒置荧光显微镜（Zeiss，型号：Zeiss IM35）配备：
1. 加热阶段设置为37°C
2. HBO灯（100W）
3. 适当的过滤器组，以检测罗丹明B荧光（Ex / Em 570/590;过滤器组20 HE）
4. 显微镜应放置在抗振显微镜台上
孵化器
微型拔片机P97（Sutter Instrument，型号：P-97）
Micromanipulator注射器（Eppendorf，Hamburg，Germany）
AgCl参考电极（光盘）

程序

设置
将微量移液器支架连接到正极和参比电极到微离子电渗电流发生器的负极。微电极支架安装在显微操纵器上（图1）

图1.实验设置我们使用配有加热阶段（设定为37℃），HBO荧光灯（100W）和适当的过滤器组的Zeiss IM35倒置荧光显微镜来检测罗丹明B荧光。显微镜放置在防振台上。微电极保持器安装在显微操纵器上，并与微电泳电流发生器的正极输出相连。参考电极连接到电流发生器的负输出（参考电极和电流发生器未在本照片上显示）。 1：加热台，2：连接用于微量移液器支架的杆，3：正极线（离子电渗发生器 - >微量吸管）4：显微操纵器（在x轴，y轴和z轴上移动），5：控制器（显微操纵器），6：温度控制器（加热台），7：电源（荧光灯），8：电源（显微操作器），9：电源（显微镜灯），10：防振显微镜台。
神经生物素示踪剂显微注射
1. 培养6cm细胞培养皿上的细胞直至达到希望的融合，例如，对于HeLa细胞，我们使用70-80％融合。
  注意：可以用任何贴壁细胞系或原代细胞培养物进行神经生物素显微注射，以确定间隙连接细胞间通讯的程度。
2. 注射前1小时：取出细胞培养液，用PBS清洗细胞，以除去细胞碎片。吸入PBS并加入2ml新鲜细胞培养基。将细胞放回孵化器。
3. 使用微量移液器拉杆从GB 100-F8P硼硅玻璃毛细管制造尖端尺寸为1-2μm的注射毛细管。
4. 通过使微量吸液管的背面与溶液接触，将神经生物素/多巴胺B异硫氰酸酯 - 葡聚糖溶液装载毛细管。移液管的毛细管力会将流体吸入尖端（图2A）
5. 当毛细管充满时，将针头插入毛细管的背面，同时用针注射器将LiCl溶液填充到LiCl溶液中。避免任何气泡（图2B）。可以通过将微量移液器吸头向下移动并用手指轻轻移动移液管来移除小气泡
6. 使用注射器和针头将微量移液管支架装入LiCl溶液。避免任何气泡（图2C）。
7. 小心地将移液器放入微量移液器支架。避免任何气泡（图2D）。
  
  图2.装载微量移液管。A.将微量吸头顶部放入含有20μl神经生物素/异硫氰酸罗丹明B - 葡聚糖溶液的500μl反应管中。移液器的毛细作用将吸引流体到尖端。 B.通过将脊髓针插入毛细管的背面，用注射器向毛细管填充LiCl溶液; C.向微量移液器支架上填充LiCl溶液; D.将移液器放入微量移液器支架。在所有步骤中避免任何气泡。该示意图的一部分改编自Servier Medical Art。
8. 将含有细胞的6cm培养皿置于显微镜下（加热阶段设定为37℃），并将参比电极置于培养基中。设置负的保持电流，以防止示踪剂从微量移液器泄漏注意：在开始显微注射之前，使用标记在培养皿底部绘制一条线，并沿着该线注入。这有助于在染色后在显微镜下回到注射的细胞。
9. 通过显微镜以10倍放大倍率观察细胞时，请使用显微操纵器小心地将微量移液管的尖端放置在要注射的细胞旁边。用移液管渗透细胞。小心不要打破培养皿底部的移液器尖端。此过程需要一些练习。
10. 从明场切换到荧光显微镜。由于红色罗丹明B荧光（E：590 nm），移液管尖应该可见。
  注意：我们建议在黑暗的房间内工作，并在实验过程中关闭主灯。这有助于在明场和荧光显微镜之间切换。
11. 通过施加20 nA的正电流10-15秒来注入示踪剂溶液。注射细胞应填充红色荧光染料。染料不应扩散到相邻的细胞中，因为若丹明B异硫氰酸酯 - 葡聚糖太大而不能通过间隙连接通道（图3A，Inset）。
12. 小心地从细胞中收集移液器尖端。
13. 重复这个步骤，每6 cm最多注入10-15个细胞。 15分钟。
神经生物素示踪剂可视化
1. 用戊二醛溶液在室温下固定细胞5分钟
2. 用PBS洗三次。
3. 使用Triton X-100溶液在4℃下使细胞过夜
4. 用PBS洗涤细胞三次。
5. 用Avidin D偶联辣根过氧化物酶溶液在室温孵育细胞90分钟
6. 用PBS洗三次。
7. 使用HistoGreen HRP底物试剂盒间接显现神经生物素。使用HistoGreen-底物将以蓝色（绿色）颜色标记接受神经生物素示踪剂的细胞（图3A-3C）。
  注意：
  1. 除了HistoGreen HRP-底物试剂盒之外，可以使用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）染色观察。
  2. 通过在显微镜下观察细胞来监测染色反应，以避免过度染色。如果即使在短时间内染色反应也应该变得太强烈，稀释抗生物素蛋白D偶联的辣根过氧化物酶溶液（配方6）或通过缩短注射时间来减少注射的神经生物素的量（步骤B11）。 >
8. 可以通过手动计数标记细胞来确定偶联细胞的数量

数据分析

对于数据分析，我们使用相差显微镜拍摄每个成功注射的细胞（图3A-3C）。一些注射可能由于微毛细血管尖端的破裂或由于过度染色而失效，并被排除在分析之外。如果染色非常强烈，我们可以排除注射液，使单细胞不能再被区分开来。间隙连接细胞间通讯（GJIC）的程度可以通过手动计数标记细胞进行评估。我们建议注射至少三个单独的6孔板（尝试每个板进行10-15次注射），并计数至少8-10次注射，以获得代表性的结果。通常我们将对照样品（例如，尚未用药理学间隙连接抑制剂处理的细胞）中的偶联细胞的平均数设置为100％偶联，并将其他结果与此比较（图3D）。作为一个例子，提出了两个不同实验的代表性数据：

用携带Cx43 ORF的表达质粒（pcDNA ^{3.1 / Zeo（+））转染的HeLa细胞注射神经生物素。使用HistoGreen HRP-底物试剂盒可视化示踪剂（蓝色）。白色星号标记注入的细胞。可以观察到示踪剂扩散到相邻的细胞中（图3A）。插图显示了与神经生物素共注射的罗丹明B异硫氰酸酯 - 葡聚糖的荧光。微量吸头的尖端以及注入的细胞是可见的（图3A插图）。用于这些实验的HeLa细胞系不显示内源性连接蛋白表达。因此，当用神经生物素注射模拟转染的HeLa细胞时，不观察到示踪剂的扩散（图3B）。}
用神经生物素注射HM-1小鼠胚胎干细胞（HM-1 mESC，Magin等人，1992）。 mESCs内源性表达间隙连接蛋白Cx31，Cx43和Cx45（Wörsdörfer等人，2008和2016）（图3C）。通过神经生物素显微注射评估，mESCs与药理学间隙连接抑制剂18-α甘氨酸浓度的依赖性（0-100μm）浓度的预孵育减少了偶联细胞的数量（图3D）。

图3.显微注射神经生物素 A.用Cx43转染的HeLa细胞注射神经生物素。白色星号标记注入的细胞。插图显示了罗丹明B异硫氰酸酯 - 葡聚糖的荧光。 B.用于本实验的亲本HeLa细胞系不显示间隙连接的细胞间通讯; C.用神经生物素注射的小鼠胚胎干细胞（mESCs） D.间接连接抑制剂18-α甘氨酸浓度依赖性（0-100μm）的mESCs的预孵育减少了偶联细胞的数量。在没有间隙连接抑制剂的情况下，偶联mESCs的数目定义为100％。刻度棒=50μm。

笔记

为了确认测定的特异性，应进行以下对照实验：
1. 通过观察罗丹明B荧光监测神经生物素显微注射。共注射的罗丹明B异硫氰酸酯 - 葡聚糖太大，不能通过间隙连接通道，不应扩散到相邻的细胞中。
2. 在神经生物素显微注射之前，可将细胞与药理学间隙连接抑制剂（例如，18-α甘氨酸或其衍生物碳烯醇，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）一起温育。这应该浓度依赖性地降低染料在相邻细胞中的扩散（Davidson等人，1988;图3D）。请注意，并不是所有的连接蛋白对这些间隙连接阻断剂都敏感：例如，Cx43对18-α甘草次苷敏感，而Cx31和Cx45不是（He＆et al。，2005;Wörsdörfer > et al。，2008）。

食谱

PBS
133 mM NaCl
2.7 mM KCl
8.1mM Na 2 HPO 4
1.5mM KH PO 4
在（dd）H 2 O O
中 pH 7.2
神经生物素/罗丹明B异硫氰酸酯 - 葡聚糖溶液（每个实验20μl）
6％（w / v）神经生物素
0.4％（w / v）若丹明B异硫氰酸酯 - 葡聚糖
0.1 M Tris碱
在（dd）H 2 O O
中 pH 7.6
储存于4°C，避光保护
LiCl溶液
注意：每个实验准备5-10毫升。
（dd）H 2 O中的1M LiCl
0.5％戊二醛溶液
1％（v / v）50％戊二醛溶液PBS（终浓度0.5％）
Triton X-100解决方案
2％Triton X-100在PBS中
抗生物素蛋白D偶联辣根过氧化物酶溶液
PBS中0.1％，
在实验前新鲜准备

致谢

波恩实验室的工作由德国研究基金会SFB645项目B2和生物医学博鳌论坛向K.W.提供支持。我们感谢KatharinaGünther对手稿进行校对。使用Servier Medical Art的图像库（ www.servier.com ）根据Creative Commons Attribution 3.0 Unported License许可。在文献中经常使用注射神经生物素作为培养细胞之间间隙连接连通的示踪剂。 Harris和Locke（2009）发表了一篇关于连接蛋白通道渗透性的广泛综述。

参考

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