材料和试剂

1,000μl移液器吸头（Corning，Axygen ^{®，目录号：TF-1000-R-S）}
200μl移液器吸头（Corning，Axygen ^{®，目录号：TF-200-R-S）}
10μl移液器吸头（Corning，Axygen ^{®，目录号：TF-300-R-S）}
Cheesecloth（阿拉丁，目录号：G6902）
90 x 15毫米培养皿（任何品牌都可以满足）
10ml离心管（Sangon Biotech，目录号：F601889）
1.5ml离心管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C）
过滤器（孔径0.45μm）（EMD Millipore，目录号：SLHV033RB）
玻璃纸（Bio-Rad Laboratories，目录号：1650963）
24孔培养板（Corning，Costar ^{®，目录号：3524）}
通过我们的实验室和全基因组测序（Li et al。，2015），分离出青霉菌 T01
甘油（AMRESCO，目录号：M152）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：T2700）
液氮
无菌蒸馏水
水（HPLC级）（Alfa Aesar，目录号：19391）
乙腈（HPLC级）（Alfa Aesar，目录号：22927）
土豆
葡萄糖（Macklin，目录号：D823520）
琼脂（HUAAOBIO，目录号：HA0552）
硝酸钠（NaNO 3）（北京化工，GB / T 647-1993）
磷酸氢二钾三水合物（K 2 O 3 HPO 4·3H 2 O）（北京化工，HG / T3487-2000）
氯化钾（KCl）（阿拉丁，目录号：P112133）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Macklin，目录号：M813599）
硫酸铁（II）七水合物（FeSO 4·7H 2 O）（阿拉丁，目录号：F116341）
蔗糖（北京化工，HG / T 3462-1999）
酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
盐酸（HCl）（AMRESCO，目录号：0369）
PDA媒体（见食谱）
CY培养基（参见食谱）
酸化蒸馏水（pH 4.0）（参见食谱）

设备

玻璃传播杆（任何品牌都可以满足）
血细胞计数器（QIUJING，型号：XB-K-25）
100-1,000μl移液器（Eppendorf，目录号：3120000267）
10-100μl移液器（Eppendorf，目录号：3120000240）
0.5-10μl移液器（Eppendorf，目录号：3120000224）
离心机（Beckman Coulter，型号：Microfuge 16，目录号：A46473）
镊子（Thermo Fisher Scientific，目录号：402011）
高效液相色谱（WATERS Corp.，MA，USA）
自动取样器（WATERS，目录号：2498）
二元HPLC泵（WATERS，目录号：1525）
UV /可见检测器（WATERS，目录号：2487）
C18柱（5μm，250 x 4.6 mm）（GL Sciences，型号：Inertsil ODS-3）
Vortexer（选择BioProducts，目录号：SBS100-2）
光学显微镜（重庆光学仪器，型号：B系列生物显微镜，目录号：B203LED）
洁净台（东联电子科技开发，型号：SCB-1520）
恒温培养箱（TAICANG，型号：THZ-C）

软件

Microsoft Excel
Empower 3.0
SPSS 13.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）

程序

用PDA（固体）培养基进行的Patulin诱导（Zong等人，2015）
1. 接种在PDA平板上的5微升孢子悬浮液（储存于-80℃的16％甘油中的5×10 6个/ ml）接种在PDA平板上（图1A）并在25℃下在黑暗中培养2周。
  用具有3-5ml 0.05％Tween 20的玻璃铺展杆（图1B）收获分生孢子，并通过四层无菌粗纱布过滤（图1C）。用血细胞计数器计数分生孢子，用无菌蒸馏水稀释至浓度为1×10 5 /分钟/ ml的分生孢子。
  
  图1.准备。膨胀孢子悬浮液。：一种。激活P。 PDA板上的膨胀 B.用0.05％吐温20收获分生孢子; C.用四层无菌的干酪包布过滤孢子悬浮液
2. 将5微升孢子悬浮液接种在9cm PDA平板的中心，并在25℃下在黑暗中孵育10天（图2A）。
3. 每个培养皿用玻璃传播杆用5ml的酸化蒸馏水（pH4.0）洗涤，孢子悬浮液用100-1000μl移液管转移到10ml离心管中（图2B）。然后，将孢子悬浮液以10,000×g离心10分钟，并通过0.45μm过滤器过滤上清液以进行patulin检测。
  
  图2.使用PDA培养基进行的Patulin诱导。 A.A。在PDA板上培养10天后，膨胀 B.用5ml酸化蒸馏水（pH 4.0）洗涤孢子悬浮液。
丙氨酸诱导用CY（液体）培养基
1. P上。膨胀孢子悬浮液如上所述制备，并用无菌蒸馏水稀释至浓度为1×10 -6分配孢子/ ml。
2. 将1μl孢子悬浮液的等分试样铺在置于PDA平板上的玻璃纸（1×1cm）上并在25℃培养36小时（图3A）。
3. 然后玻璃纸被
  P覆盖。菌丝体将菌丝体转移至CY液体培养基。每个玻璃纸在24孔培养板中漂浮在1ml CY液体培养基上（图3B）。整个板用Parafilm覆盖并密封，然后在25℃在黑暗中的静态条件下培养。
4. 转移后48h，用镊子收集菌丝体和孢子，并用液氮快速冷冻以进行其他一些用途（RNA / DNA /蛋白质提取），并通过0.45μm过滤器过滤培养基（图3C）进行蛋白质检测。
  
  图3.具有CY培养基的Patulin诱导 A.放置在PDA平板上的玻璃纸片（1×1cm）上孵育的膨胀菌菌丝体; B.用在24孔培养板中的CY液体培养基上培养的菌丝体覆盖的玻璃纸; C.清除菌丝体后的CY培养基
HPLC分析
1. 执行高效液相色谱分析以确定patulin生产
2. 将10μl滤液萃取液注入配有自动进样器（WATERS 2498），二元HPLC泵（WATERS 1525）和UV /可见检测器（WATERS 2487）的液相色谱仪中。使用C18柱（5μm，250×4.6mm，GL Sciences，Japan）进行patulin检测
3. 流动相是在等度洗脱模式下，流速为1ml / min的水和乙腈（90:10，v / v）的混合物。
4. patulin的检测波长为276nm，柱温箱设定在25℃

数据分析

构建标准曲线
以20,50,100,200和250μg/ ml的浓度制备patulin溶液。注入柱中的体积为10μl。在上述实验条件下，HPLC分析中patulin的保留时间约为9.28分钟（图4A）。使用线性回归法通过使用五种溶液的五次注射的峰面积的平均值来制备标准曲线（图4B）。标准曲线的方程为：

＆NBSP;＆NBSP; ＆NBSP; E = 50990C + 39869R²= 1

其中E是注射的patulin的峰面积（10μl），C是注射的标准patulin的浓度（μg/ ml）。
实验样品的浓度可以通过HPLC读取的patulin保留时间（9.28分钟）的相应峰面积计算。

图4. HPLC分析（A）和patulin标准曲线（B）
统计分析
然后可以用SPSS 13.0统计软件分析来自三个独立实验的数据，每个实验有五个重复。使用Duncan的多范围测试进行ANOVA测试; 0.05。

食谱

PDA媒体（1升）
200克土豆
20克右旋糖
15克琼脂
将200克切片的土豆在1升蒸馏水中煮沸30分钟，然后通过干酪布滗析肉汤，并在肉汤中加入20克葡萄糖和15克琼脂粉末。加入蒸馏水组成1升，培养基通过121℃高压灭菌20分钟灭菌
CY培养基（1L）
3g NaNO 3
1 g K 2 2 HPO 4·3H 2 O - / - 0.5克KCl
0.5g硫酸镁·7H 2 O 2·
0.01g FeSO 4·7H 2 O
30克蔗糖
5克酵母提取物
dH <2> O至1 L
加入HCl调节至pH 5.2，121℃高压灭菌20分钟
酸化蒸馏水（pH 4.0,100 ml）
准备100ml蒸馏水，用HCl调节至pH 4.0，通过0.22μm过滤器无菌过滤

致谢

该协议由Li等人（2015）和Zong等人改编。（2015）。这项工作得到了中国科技部的支持（授权号码2016YFD0400902）。

参考

Baert，K.，Meulenaer，B.，Kasase，C.，Huyghebaert，A.，Ooghe，WB and Devlieghere，F。（2007）。＆nbsp; 多云苹果汁中的自由和结合的蛋白酶。食品化学 100：1278-1282。 />

Brause，AR，Trucksess，MW，Thomas，FS and Page，WS（1996）。＆nbsp; 通过液相色谱法测定苹果汁中的patulin：合作研究。 J AOAC Int 79：451-455。

欧洲委员会条例（2006）。委员会条例EC 1881/2006设定食品中某些污染物的最高水平。 Eur Commun L364：5-24。

Li，B.，Zong，Y.，Du，Z.，Chen，Y.，Zhang，Z.，Qin，G.，Zhao，W。和Tian，S。（2015）。基因组表征揭示了青霉属物种中patulin生物合成和致病性的见解。。Mol Plant Microbe Interact 28（6）：635-647。

Zong，Y.，Li，B.and Tian，S。（2015）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26001378”目标=“_ blank”>碳，氮和环境pH对青霉素生产和相关基因表达的影响 Int J Food Microbiol 206：102 -108。