材料和试剂

个人防护设备（安全眼镜，实验室外套，手套）
1.5毫升卡帽管
带盖的24孔板（VWR，目录号：734-2325）
塑料巴斯德移液器（VWR，目录号：LSUK711117S / 20）
手动移液器提示（Eppendorf，Research plus和Repeater plus或类似样式）
铝箔
MARIENFELD玻片，低自发荧光，L x B x H：76 x 26 x 1 mm;预洗涤;接地边缘，90°幻灯片（VWR，目录号：631-9464）
精密盖玻片，厚度1.5H（Marienfeld-Superior，目录号：0107222）
15毫升Falcon管（VWR，目录号：734-0452）
拟南芥成熟，干种子
针对植物细胞壁碳水化合物的一抗，获自：
1. CarboSource（ http://www.ccrc.uga.edu /〜carbosource/CSS_home.html ）
2. 植物探针（ http://www.plantprobes.net/index.php）
Alexa Fluor 488次抗体（针对第一抗体的宿主）
1. 山羊抗小鼠（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11001）
2. 山羊抗大鼠（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11006）
透明指甲油
磷酸钠，二元碱（Na 2 HPO 4·2H 2 O）（Carl Roth，目录号：4984.2）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4·2H 2 O）（Carl Roth，目录号：T879.2）
牛血清白蛋白（BSA），不含IgG（Carl Roth，目录号：3737.2）
Pontamine S4B（以直接红23的形式出售）（Sigma-Aldrich，目录号：212490-50G）
氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：P029.1）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.0（参见食谱）
阻塞解决方案（见配方）
抗体溶液（参见食谱）
在50mM NaCl中的0.01％（w / v）S4B（参见食谱）

设备

手动移液器（Eppendorf，型号：Research ^{® plus和Repeater ^{® plus;或类似样式）}}
净水系统（Milli-Q或类似风格）
平衡
高压灭菌器
轨道摇床
涡旋搅拌机（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2;或类似款式）
Leica TCS SP8共焦显微镜（Leica Microsystems，型号：TCS SP8）具有以下关键部件：
1. DM 5000立式显微镜，手动阶段
2. HC PL APO 10x / 0.40 CS（Leica Microsystems，目录号：15506285）目标
3. 具有488 nm和552 nm固态激光器的紧凑型LIAchroic AOTF单元
4. SP8扫描头带有无滤光片光谱检测的LIAchroic分光器
  注意：或者，使用配有基于过滤器的检测的常规共聚焦显微镜。设计用于绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）的滤光片通常适用于获得Alexa Fluor 488和Pontamine（ S4B信号。在该方案中，在500-530nm和590-700nm范围内检测到荧光团的发射。
5. 两个荧光光电倍增管和一个透射光检测器
6. 扫描光学模块艾滋病病毒与旋转
用于图像采集和处理的计算机

软件

用于图像采集的Leica Application Suite X（LAS X）软件
斐济只是ImageJ（斐济）图像处理包（ https://fiji.sc/ ）

程序

抗体选择和排序
1. 基于以前的出版物或WallBioNet抗体热图（ http： //glycomics.ccrc.uga.edu/wall2/antibodies/antibodyHome.html ; Pattathil等人，2010），选择至少一种针对感兴趣的粘液成分的一级抗体。注意用于产生抗体的动物宿主，多糖交叉反应性和碳水化合物抗原的表位结构（如果已知）。
  实施例：CCRC-M30是针对拟南芥种子粘液的小鼠单克隆抗体，并且主要从54种植物多糖的不同组合中结合富含果胶的底物（Pattathil等人，2010）。
  注意：如果使用2F4抗体（Liners等人，1989）或His标记的碳水化合物定向模块（例如，CBM3a; Blake等人，2006），则必须分别制备替代溶液或附加标记步骤（Voiniciuc et al。，2013和2015b）。
2. 订购感兴趣的第一抗体和相应的Alexa Fluor 488二抗。
  例如：对于CCRC-M30，使用山羊抗小鼠抗体。
3. 初级抗体应分装在1.5 ml管中，储存于-20°C。一旦管被解冻，将其在黑暗中保存在4°C，直到其完全用完。
准备种子进行免疫标记
1. 将24孔板的盖子标记为将要分析的样品的名称。始终至少包含一个阴性对照。
  实施例：除了一级抗体被省略之外，将与感兴趣的样品一起制备的野生型种子。
2. 使用中继器移液管，用500μl超纯水（25°C时为18.2MΩcm）将板的每个孔填充。
3. 对每个孔，加入约20个拟南芥干/干成熟种子。
  注意：存储在小纸袋中的种子可以直接转移到井中，从而最大限度地减少污染的风险。有关种子收获和粘液分析储存条件的更详细说明，请参阅（Voiniciuc和Günl，2016）的方案。
4. 用盖盖住24孔板，并在卧式摇床上孵育5分钟。对于所有的振动步骤，使用轨道振荡器在100 rpm和室温（〜23°C）。
5. 使用1000μl移液管，从每个孔中清除470μl的水。
  注意：这从种子中除去非粘附的粘液。仔细倾斜板和移液器，以避免与液体一起除去任何种子。
6. 使用中继器移液管加入100μl新鲜的阻塞溶液。
7. 盖上盖子摇匀30分钟
8. 用200μl移液管清除100μl封闭溶液。
一抗标记
1. 对“无一抗”阴性对照，加入50μl纯抗体溶液。
2. 向每个样品中加入50μl抗体溶液中1:10稀释的一抗。
  注意：准备一份含有5μlCCRC-M30抗体的新鲜主混合物，每个样品加上45μl抗体溶液。对于大多数测试的抗体，这种稀释效果很好。
3. 用盖盖住24孔板，摇动90分钟。
4. 用200μl移液管取出50μl的一级抗体溶液。
  注意：如果在一个平板上使用两个或更多个主要抗体，请更改提示。
5. 使用中继器移液管向每个孔中加入300μlPBS。
6. 通过手动摇动板两次，轻轻地将种子混合在PBS洗液中。使用塑料巴斯德移液器丢弃洗涤液，不要去除种子。
7. 通过重复步骤C5和C6进行四次PBS洗涤。
二次抗体标记
1. 除去最终的洗涤溶液后，加入100μl用抗体溶液1：100稀释的适当的二抗。
  实施例：对于CCRC-M30标记，加入新鲜制备的1μlAlexa Fluor的混合物488山羊抗小鼠抗体和99μl抗体溶液。
2. 摇动24孔板，盖上盖子并裹在铝箔上90分钟
3. 用200μl移液管取出100μl二抗溶液。
  注意：如果在一块板上使用不同的二次抗体，请更改提示。
4. 使用中继器移液管向每个孔中加入300μlPBS。
5. 通过手动摇动板两次，轻轻地将种子混合在PBS洗液中。使用塑料巴斯德移液器丢弃洗涤液，不要去除种子。
6. 通过重复步骤D4和D5进行四次PBS洗涤。
7. 最后一次洗涤后，种子可以在4℃的黑暗中保存在300μl的PBS中过夜，或者立即用于下列步骤。
  注意：将种子保留在24孔板中，直到准备好转移到玻璃片上进行共焦成像。
种子复染（可选）
1. 相对于用Pontamine S4B复染的种子表面，最好检查胶体胶囊中碳水化合物表位的分布。
  注意：对于结果的解释，重新选择复数是很重要的。 S4B特异性结合纤维素微原纤维不同于通常使用的Calcofluor染色剂，其在果胶半乳聚糖，木聚糖和半乳甘露聚糖存在下也发荧光（Anderson等人，2010）。
2. 向每个孔中加入300μl新鲜的0.01％（w / v）Pontamine S4B在50mM NaCl中
3. 摇动24孔板，盖上盖子并裹上铝箔30分钟
4. 用塑料巴斯德吸管移除S4B溶液。
5. 使用中继器移液管向每个孔中加入300μl水。
6. 用水轻轻搅拌种子两次。使用塑料巴斯德移液器丢弃洗涤液，不要去除种子。
7. 通过重复步骤E5和E6进行两次额外的水洗。
8. 种子准备成像，可以使用塑料巴斯德吸管或1,000μl移液管将其转移到载玻片（每个样品一个）。
9. 将盖玻片（厚度1.5H）放置在每个含有种子的液滴上，并加入额外的水（如果需要）。如果样品储存时间超过60分钟，盖玻片应用指甲油密封到玻璃片上，以限制蒸发。
图像采集和处理
1. 使用配备在Leica TCS SP8共焦系统上的10x物镜检查含有全种子的每个载玻片。
  注意：可以激发和检测绿色和红色荧光蛋白（GFP和RFP）发射的其他显微镜也是合适的。
2. 初始化共焦硬件和Leica Application Suite X（LAS X）软件，开始图像采集。打开488 nm和552 nm固体激光器。
3. 使用透射光和手动舞台控制来关注感兴趣的种子。
4. 使用488nm和552nm固态激光器同时激发Alexa Fluor <48>和48B，并使用两个荧光光电倍增管（PMT; PMT 1 = 500-530nm; PMT 2 = 590-700纳米）。
  注意：如果两个或更多个荧光团之间没有明显的串扰，则仅使用同时采集。否则，共焦系统应该在顺序扫描模式下使用。图1显示，上述参数可以分开Alexa Fluor 488和S4B。
  
  图1.检测两个荧光团的激发和发射参数。 A-I。在与CCRC-M30免疫标记的野生型（Col-0）种子周围的相同粘液区域的单一光学切片并用S4B复染色。使用不同的激发（Ex）和发射（Em）参数获得荧光信号。图像在斐济处理。棒=75μm。
5. 简单比较准备的不同样品和对照的荧光，然后设置整个实验的最终采集设置（例如，扫描格式，每个激光的功率，每个检测器的增益）。
  实施例：图2显示了Col-0野生型和muci21-1突变种子的CCRC-M30和S4B标记。与这些样品相反，使用在不含CCRC-M30一抗和S4B染料的情况下制备的野生型种子周围的相同采集设置，也没有检测到粘液荧光。
  
  图2.野生型和muci21-1种子周围的果胶和纤维素分布。A-I。使用相同采集参数成像并在斐济平行处理的三种不同种子的单个光学部分。阴性对照（G至I）表示不含CCRC-M30一抗和S4B复染色培养的野生型（Col-0）种子。酒吧= 200μm。
6. 使用相同的采集设置为每个样品获取多个种子的Z-堆叠。使用扫描场旋转来分析来自类似方向的所有种子。
7. 获得的Leica共焦图像（.lif文件格式）可以加载在斐济图像处理包中，用于处理和/或导出出版图像（Schindelin等人，2012年）。

食谱

磷酸缓冲盐水（PBS），pH 7.0
1. 混合5.34g磷酸钠，二元（30mM终浓度）和3.12g磷酸钠，一元（20mM终浓度）
2. 加入900ml纯净水，搅拌溶解盐
3. 检查pH = 7.0，如有必要，进行调整
4. 用水填充至1000毫升，再次搅拌，然后高压灭菌
  注意：无菌解决方案至少保持1年。
阻塞解决方案
1. 称量0.5g BSA在15ml Falcon管中，并用PBS将其填充至10ml
2. 涡旋混合，直到BSA完全溶解
  注意：每次都会使此解决方案变得新鲜。
抗体溶液
1. 称取0.1g BSA在15ml Falcon管中，并用PBS将其填充至10ml
2. 涡旋混合，直到BSA完全溶解
  注意：每次都会使此解决方案变得新鲜。
在50mM NaCl中的0.01％（w / v）S4B
1. 每10ml超纯水溶解0.5 g的Pontamine S4B，以制备5％（w / v）浓缩的储备溶液，该溶液在黑暗中在4℃下稳定数月。
2. 将5.84g NaCl溶于100ml超纯水中，高压釜中制备100mM NaCl浓缩液。无菌溶液至少稳定1年
3. 对于每个实验，在含有0.6μl5％（w / v）的S4B，150μl100mM NaCl和149.4μl超纯水的50mM NaCl主混合物中制备新鲜的0.01％（w / v） br />

致谢

该方案由（Voiniciuc等人，2015a）简要描述，并且由（Young等人，2008; Harpaz-Saad等人，2011）进行了修改）方法。在加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC PGS-D3授权）的支持下，我在ForschungzentrumJülich博士BjörnUsadel博士的实验室进行了这项工作。

参考

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