材料和试剂

无菌标本容器（Fisher Scientific，目录号：16-320-730）
12孔组织培养板（Corning，Falcon ^{®，目录号：351143）}
无菌培养管（4ml）（Fisher Scientific，目录号：14-956-3D）
微量离心管（1.7ml）（Fisher Scientific，目录号：S348903）
玻璃闪烁瓶（20ml）（Sigma-Aldrich，目录号：Z253081）
无菌培养管（15ml）（Fisher Scientific，目录号：14-956-6D）
所需的菌株（例如，例如，变形链球菌OMZ175）
推荐的心脏组织
EGM-MV子弹套件（Lonza，目录号：CC-3125）
庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1397）
脑心浸液（BHI）（BD，Bacto ^{TM，目录号：237500）}
Hank的平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14025092）}
红霉素（Sigma-Aldrich，目录号：E5389）
卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K1377）
氯化钠（NaCl）（Avantor Performance Materials，J.T.Baker ^{，目录号：3628-01）}
氯化钾（KCl）（Avantor Performance Materials，J.T.Baker ^{，目录号：3045-01）}
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Avantor，Performance Materials，JTBaker，目录号： 3827-01）
磷酸二氢钾（KH 2 O 3 PO 4）（AvantorPerformance Materials，JT Baker，目录号： 3246-01）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
戊二醛（Sigma-Aldrich，目录号：340855）
三水合二钠（Sigma-Aldrich，目录号：C0250）
琼脂（Fisher Scientific，目录号：BP1423）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F0392）
氢化可的松
牛脑提取物
人重组表皮生长因子
1x磷酸缓冲溶液（PBS）（参见食谱）
固定溶液（参见食谱）

设备

生物安全柜2级（Nuaire，型号：Labgard ES节能二级，A2型，目录号：NU-425-600）
3 mm皮肤活检穿孔（Acuderm，目录号：P325）
不锈钢钳（Sigma-Aldrich，目录号：Z168696）
离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Heraeus ^{TM Multifuge ^{TM 1 S-R）}}}
涡流
电动杵（Kimble Chase Life Science and Research Products，目录号：7495400000）
pH计
摇杆（可靠科学，型号：55D）
CO 2培养箱（VWR;型号：2325）
蔡司 - Auriga聚焦离子束场发射扫描电子显微镜（FIB-FE-SEM）
Gatan Erlangshen数码相机

程序

样品收集和准备
1. 否则将被丢弃的主动脉瓣组织应从心脏手术专家接受主动脉瓣置换的患者中无菌除去。
2. 手术后立即将组织置于无菌标本容器中，保存在冰上，并立即送至实验室进行处理。
组织准备
1. 在生物安全柜中，打开包含心脏组织的小瓶，并在进一步加工之前评估钙化水平，炎症和损伤。理想情况下，瓣膜切片应从没有钙化，炎症征象或残留血液的平滑区域获得（图1）。
2. 使用活检穿孔器，牢牢地按压在组织的选定区域以切割并从其余组织中移除部分（图1）。
  
  图1.来自主动脉瓣组织的组织选择获得主要组织后，应立即将其送至实验室进行评估和准备。只有没有钙化或炎症迹象的区域选择用3 mm活检穿刺切片。
3. 使用无菌镊子收集切片，并将其置于含有1ml补充EGM +庆大霉素300μg/ ml的12孔板的各个孔中。
4. 可以有效获得的部分数量取决于组织的质量和尺寸以及要进行的实验类型（见下文）。
5. 将含有阀部分的12孔板在37℃下在5％CO 2气氛中孵育过夜（18-20小时）。
细菌附着于主动脉瓣组织
1. 在瓣膜组织处理的同一天，一式三份培养一夜细菌培养物。成长。变形菌 OMZ175，在4ml无菌培养管中加入2ml BHI，并通过从新鲜条纹板中挑选单个分离的菌落进行接种。
2. 在37℃下在5％CO 2气氛中孵育培养物过夜（18-20小时），不通风。
3. 第二天，用HBSS缓冲液在室温下清洗两次阀门部分以除去残留的抗生素。为此，将1ml HBSS加入同一板的两个干净的空孔中，并使用无菌镊子转移切片。轻轻摇动板上含有阀门5分钟，将每个洗涤步骤的摇杆设定为每分钟40-50次。
4. 同时，在4℃下以3,500×g离心过夜培养物10分钟，用无菌PBS洗涤两次，并以初始培养体积重新悬浮培养物。
5. 对于每个菌株重复，将2.7ml没有抗生素的新鲜EGM加入到干净的4ml无菌培养管中，并加入300μl细菌培养物，使细菌悬浮液的1:10稀释（约1×10 7 / sup > CFU ml ^{-1 ）。}
6. 将洗涤的阀切片转移到新的12孔板上，并在EGM中加入1ml细菌悬浮液。另外，每个重复使用100μl进行连续稀释和初始培养CFU（T <0>）的铺板。
7. 在37℃下在5％CO 2气氛中孵育板，轻轻晃动90分钟。
8. 孵育后，将每个瓣膜部分转移到含有1ml HBSS的1.7ml微量离心管中，然后以中等强度涡旋5秒。这个过程应该进行三次，以便去除松散结合的细菌
9. 洗涤后，将每个瓣膜部分置于含有500μlPBS的4ml无菌培养管中，并用电动杵将组织匀浆2分钟，以分离紧密粘附的细菌。
10. 从均质阀悬浮液中取100μl等分试样进行连续稀释，并在BHI培养基平板上铺板最终培养物，以确定CFU（T ）。
11. 将接种的板在37℃下在5％CO 2气氛中孵育。 48小时后，计数菌落进行CFU测定。
通过扫描电子显微镜（SEM）分析粘附的组织制备
1. 通过SEM观察细菌对心脏瓣膜切片的粘附，按照上述接种方案（步骤3a-3g）。
2. 在用细菌培养组织后，将每个瓣膜部分转移到含有1ml HBSS的1.7ml微量离心管中，然后以中等强度涡旋5秒。
  注意：在这个阶段，重要的是不要进行太多的洗涤，因为SEM样品制备包括几个洗涤步骤。
3. 洗涤后，将阀部分转移到含有15ml固定液的标记玻璃闪烁瓶中
4. 样品在4℃下用轻微摇摆固定48小时后，即可进行SEM分析
细菌附着的竞争分析
1. 在瓣膜组织处理的同一天，一式三份培养一夜细菌培养物。与单一培养接种不同，该方案需要明显的菌株，以便在CFU测定中可以区分。
2. 对于这项研究，包含红霉素抗性盒（Erm ^{R ）和S 的变体链OMZ175。使用由卡那霉素抗性盒（Kan ^{R ）中断的具有胶原结合蛋白基因（OMG175）的变体链霉素OMZ175。}}
3. 为了培养细菌培养物，在4ml无菌培养管中加入2ml BHI + Erm10μg/ ml，或BHI + Kan 1mg ml -1，在4ml无菌培养管中，并通过从新鲜的条纹板挑选殖民地。
4. 在37℃下在5％CO 2气氛中孵育培养物过夜（18-20小时），不通风。
5. 第二天，用HBSS缓冲液在室温下清洗两次阀门部分以除去残留的抗生素。为此，将1ml HBSS加入同一板的两个干净的空孔中，并使用无菌镊子转移切片。轻轻摇动板上含有阀门5分钟，将每个洗涤步骤的摇杆设定为每分钟40-50次。
6. 同时，在4℃下以3,500×g离心过夜培养物10分钟，用无菌PBS洗涤两次，并以初始培养体积重新悬浮培养物。
7. 对于每个菌株重复，将2.7ml没有抗生素的新鲜EGM加入到干净的4ml无菌培养管中，并加入300μl细菌培养物，使细菌悬浮液的1:10稀释（约1×10 7 / sup > CFU ml ^{-1 ）。}
8. 将洗涤的阀部分转移到新的12孔板中，并加入500μl的S。变形菌 OMZ175（Erm ^{R ）和500μl的S。在EGM中的变体链细胞悬浮液（Δ）。另外，取100μl的每个混合细菌重复进行连续稀释和初始培养CFU（T <0>）的铺板。}
9. 将接种的阀门部分在37℃下在5％CO 2/2气氛中孵育90分钟。轻轻摇摆90分钟。
10. 孵育后，将每个瓣膜部分转移到含有1ml HBSS的1.7ml微量离心管中，然后以中等强度涡旋5秒。该过程应重复三次以除去松散结合的细菌。
11. 洗涤后，将每个瓣膜部分置于含有500μlPBS的4ml无菌培养管中，并用电动杵将组织匀浆2分钟，以分离紧密粘附的细菌。
12. 从均质阀悬浮液中取100μl等分试样进行连续稀释，并将最终培养物在BHI + Erm10μg/ ml和BHI + Kan 1mg ml -1上进行铺板>板以确定CFU（T ）
13. 将接种的板在37℃下在5％CO 2气氛中孵育。 48小时后，计数菌落进行CFU测定。

数据分析

为了细菌粘附的可视化，组织应通过SEM彻底检查（图2）。组织的顶部和底部是心脏瓣膜连续暴露于动脉血流并且通常未损伤的区域，被称为光滑表面。由于活检冲孔破裂而显示胶原纤维的组织边缘被称为粗糙表面。

图2.粘合力变形菌 OMZ175与人类主动脉瓣切片。粘连。通过SEM分析人类主动脉瓣切片的变体链。中心图像是阀部分的低倍率（25倍）图像（比例尺= 200μm）。以5,000x放大倍率（比例尺=1μm）取代附着细菌至粗糙（A）和光滑表面（B）的代表性图像。＆lt; em＆gt;离体粘附。变性链霉素OMZ175（黑色箭头）对人体瓣膜切片需要胶原蛋白结合蛋白Cnm，因为在Δ菌株中没有检测到细菌。
要计算竞争力指数（CI），必须按照以下公式确定和应用CFU：

Inoculum = T _{0 ;基板= T}
然后将值绘制在列散点图上，并使用具有Bonferroni事后比较的单因素方差分析进行分析，以确定菌株对之间的底物偏好。 CI值为1表示菌株之间的粘附性无差异;与参考菌株相比，低于1的CI值表示测试菌株的结合度较小;与参考菌株相比，高于1的CI值表示测试菌株的结合度一个代表性的图表显示了S的竞争力指数（CI）。变形菌 OMZ175及其相对应的Δ如下所示。图中的每一点代表使用不同组织样本的单独实验。变异性来自组织的性质，因为每个患者的样本不完全相同（图3）

图3.S分析。变体链 OMZ175及其Δ对应。使用上述CI式，对于两个菌株，在T 0 O和T F F CFU处计算CI值。平均CI高于1，表示S。变形菌 OMZ175比较其对应的Δ cnm 。 OMZ175中Cnm的表达增强细菌粘附人类主动脉瓣组织的能力。

笔记

涉及人类受试者的所有议定书必须事先得到机构审查委员会的批准。该方案使用由于钙化狭窄进行主动脉瓣置换的心脏手术患者的丢弃组织建立。 18岁以下的患者，孕妇和艾滋病毒阳性患者被排除在原来的研究之外。
所有组织应在离体结合分析之前单独和彻底评估。这是由于每个患者的钙化，炎症和组织损伤程度不同。
组织应在6 h内进行处理。如果需要，可以在进行定殖测定之前将组织加工并放置在EGM +庆大霉素300μg/ ml中达72小时。
对于这项研究，SEM的组织可视化由罗切斯特大学医学中心电子显微镜核心进行。使用Zeiss-Auriga聚焦离子束场发射扫描电子显微镜（FIB-FE-SEM）分析样品，并使用附加的Gatan Erlangshen数码相机捕获图像。
针对竞争实验的输入细菌数量（添加到组织中的细菌细胞的总数）先前被确定为与S大致相似。变体链 OMZ175及其Δ对应物。同样地，在竞争分析之前，应该对待测试的任何细菌菌株确定CFU输入。为了保持重复性，我们建议将细菌培养物调整至特定的OD 600 nm以匹配菌株之间的CFU数量。

食谱

1x磷酸盐缓冲溶液（PBS）
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
2mM KH PO 4
固定解决方案
4％多聚甲醛
2.5％戊二醛
0.1M二聚氰酸钠
EGM-MV Bulletkit
500毫升EGM完成培养基
5％胎牛血清
500毫克氢化可的松
6毫克牛脑提取物
0.1％人重组表皮生长因子

致谢

感谢罗切斯特大学的Michael Swartz和Peter Knight的样品收集。这项工作得到NIH-NIDCR（R01 DE022559）的支持。 A.A.-R.由NIH-NHLBI（F31 HL124951）支持。 I.A.F.得到了圣保罗研究基金会（FAPESP，Brazil，2013 / 25080-7）的支持。该协议是由Chuang-Smith等人，2009年的研究的修改版本。

参考

Banas，JA（2004）。＆nbsp; 变形链球菌。前面的Biosci 9：1267-1277。
创业史密斯，ON，Wells，CL，亨利 - 斯坦利，MJ和Dunny，GM（2010）。＆nbsp; 通过心脏瓣膜定植的离体模型中的聚集物质表达来促进粪肠球菌生物膜形成。 PLoS One < / em> 5（12）：e15798。

Freares，IA，Aviles-Reyes，A.，Kitten，T.，Simpson-Haidaris，PJ，Swartz，M.，Knight，PA，Rosalen，PL，Lemos，JAand Abranches，J。（2016）一个class =“ke-insertfile”href =“https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Heterologous+expression+of+Streptococcus+mutans+Cnm+in+Lactococcus+lactis+promotes+细胞内+入侵％2C +粘附+至+人类心脏+ + +组织和毒力+“。目标=“_ blank”>乳酸乳球菌中的变异链球菌Cnm的异源表达促进细胞内侵袭，对人心脏组织的粘附和毒力。毒力< / em> 3：1-12。

Que，YA和Moreillon，P.（2011）。感染性心内膜炎 Nat Rev Cardiol 8：322-336。

Yetkin，E.和Waltenberger，J.（2009）。＆nbsp; Int J Cardiol 135：4-13。