材料和试剂

含有病毒颗粒的shRNA的产生
1. 175厘米组织培养瓶（Corning，Falcon ^{，目录号：353112）}
2. 提示
  0.1-10μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM，目录号：02-681-440）
  1-200μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM ，目录号：02-707-502）
  101-1,000μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM ，目录号：02-707-509）}}}
3. 15ml锥形管（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM，目录号：05-539-5）}
4. 10厘米盘（康宁，目录号：353803）
5. 10ml注射器（BD，目录号：309604）
6. 0.45μm注射器过滤器（EMD Millipore，目录号：SLHV033RS）
7. HEK293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
8. 表达shRNA的慢病毒载体（Sigma-Aldrich）击倒：
  一个。 BRD2：TRCN0000006308和TRCN0000006310
  湾BRD4：TRCN0000021424和TRCN0000021428
  C。细胞周期蛋白T1：TRCN0000013673和TRCN0000013675
  天。对照：含有scramble shRNA的pLKO.1载体即慢病毒包装结构pCMVdelta R8.91（Naldini等人，1996）
  F。 VSV-G糖蛋白表达载体（Naldini等，1996）
9. DMEM（Mediatech，目录号：10-013-CV）
10. 胎牛血清（FBS）（Gemini Bio-Products，目录号：100-106）
11. L-谷氨酰胺（Mediatech，目录号：25-005-Cl）
12. 100x青霉素/链霉素（Mediatech，目录号：30-002-Cl）
13. 1x PBS（Mediatech，目录号：21-031-CV）
14. 胰蛋白酶-EDTA（Mediatech，目录号：25-052-Cl）
15. 二氯磷酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：C6628）
16. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
17. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
18. 葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：BP350-1）
19. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
20. 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：BP332-500）
21. 氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
22. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
23. 不含Nuclease的H 2 O（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，Sup。，目录号：AM9937）
24. Lenti-X ^{TM p24快速滴定试剂盒（Takara Bio，Clontech，目录号：632200）}
25. 25毫克氯喹（见食谱）
26. HBSS缓冲区（见配方）
27. 2 M CaCl 2 （见配方）
28. 甘油冲击溶液（见食谱）
感染A2和A72 J-Lat细胞
1. 75厘米组织培养瓶（Corning，Falcon ^{，目录号：353110）}
2. 6孔组织培养板（Corning，Falcon ^{®，目录号：353224）}
3. Posi-Click ^{TM 1.7ml微量离心管（Denville Scientific，目录号：C2170）}
4. 提示
  0.1-10μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM，目录号：02-681-440）
  1-200μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM ，目录号：02-707-502）
  101-1,000μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM ，目录号：02-707-509）}}}
5. A2和A72 J-Lat细胞（Jordan等人，2003）
6. RPMI（Mediatech，目录号：10-040-CV）
7. 胎牛血清（FBS）（Gemini Bio-Products，目录号：100-106）
8. L-谷氨酰胺（Mediatech，目录号：25-005-Cl）
9. 100x青霉素/链霉素（Mediatech，目录号：30-002-Cl）
10. Polybrene ^{®（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-134220）}
11. 嘌呤霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P7255）
12. 聚乙烯溶液（参见食谱）
通过流式细胞术分析HIV-1 LTR转录激活
1. 96孔组织培养板和盖子（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：249570和163320）}
2. 提示
  0.1-10μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM，目录号：02-681-440）
  1-200μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM ，目录号：02-707-502）
  101-1,000μl（Fisher Scientific，Fisherbrand ^{TM ，目录号：02-707-509）}}}
3. A2和A72 J-Lat细胞（Jordan等人，2003）
4. 1x PBS（Mediatech，目录号：21-031-CV）
5. RPMI（Mediatech，目录号：10-040-CV）
6. 胎牛血清（FBS）（Gemini Bio-Products，目录号：100-106）
7. L-谷氨酰胺（Mediatech，目录号：25-005-Cl）
8. 100x青霉素/链霉素（Mediatech，目录号：30-002-Cl）
9. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
10. TNFα（PeproTech，目录号：300-01A），在无菌H 2 O中制备100ng /μl的储备溶液
11. 7AAD，碘化丙啶或其中一种僵尸活力染料
12. JQ1（Cayman Chemical，目录号：11187），在DMSO中制备10mM的储备溶液
13. MACSQuant运行缓冲区（Miltenyi Biotech，目录号：130-092-747）
14. ApoTox-Glo ^{TM Triplex Assay（Promega，目录号：G6320）}
通过SDS-PAGE和Western blot确定shRNA敲低效率
1. Posi-Click ^{TM 1.7ml微量离心管（Denville Scientific，目录号：C2170）}
2. 硝酸纤维素膜0.2μm（Bio-Rad Laboratories，目录号：1620112）
3. Whatman论文（GE Healthcare，目录号：3030-917）
4. 高性能化学发光膜（GE Healthcare，目录号：28906839）
5. Trizma ^{®基质（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）}
6. NP-40（Igepal CA-630）（Sigma-Aldrich，目录号：I3021）
7. 脱氧胆酸钠（脱氧胆酸，钠盐）（Fisher Scientific，目录号：BP349-100）
8. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号：BP166-500）
9. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
10. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
11. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Fisher Scientific，目录号：S311-500）
12. 氟化钠（NaF）（Sigma-Aldrich，目录号：S6521）
  注意：本产品已停产。
13. 蛋白质测定（试剂A，B和S，Bio-Rad Laboratories，目录号：5000113,5000114,5000115）
14. 凝胶（Bio-Rad Laboratories，目录号：4569034）
  ＆lt; TG＆gt;＆lt;
15. PageRuler ^{TM 预染蛋白梯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：26617）}}
16. 免疫印迹的抗体
  1. 兔多克隆抗BRD2（Cell Signaling，目录号：5848）
  2. 兔多克隆抗BRD4（Abcam，目录号：ab75898）
  3. 兔多克隆抗Cyclin T1（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-10750）
  4. 兔多克隆抗-α-微管蛋白（Abcam，目录号：ab15246）
  5. 山羊抗兔IgG，HRP缀合（Bethyl Laboratories，目录号：A120-201P）
17. Tween ^{® 20（Fisher Scientific，目录号：BP337-500）}
18. 甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：BP381-5）
19. 甲醇（Fisher Scientific，目录号：A433P-4）
20. 印迹级阻滞剂（干牛奶）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706404）
21. Lumi-light Western印迹底物（Roche Diagnostics，目录号：12015200001）
22. RIPA缓冲区（请参阅配方）
23. 蛋白质印迹运行缓冲液（参见食谱）
24. Western印迹转移缓冲液（pH 8.3）（参见食谱）
25. TBS-T缓冲（见配方）

设备

移液器
生物安全柜“二级”
用于Eppendorf管的台式离心机（Eppendorf，型号：5415 D）
用于96孔板，Eppendorf，15ml和50ml管的台式离心机;用于自旋感染（Beckman Coulter，型号：Allegra X-14R）
CO 2组织培养培养箱，37℃（Thermo Electron，型号：Forma＆lt; sup＆gt; Steri-Cult＆lt;＆gt; CO 2＆lt; / sub >孵化器，目录号：3307）
MACSQuant VYB FACS分析仪（Miltenyi Biotech，型号：MACSOuant ^{® VYB，目录号：130-096-116）}
Mini-PROTEAN ^{®电泳系统（Bio-Rad Laboratories，catalog-number：1658006FC和1703935）}
PowerPac ^{TM HC（Bio-Rad Laboratories，型号：Power Pac HC Highe-Current Power Supply，目录号：1645052）}
Rocker II（Boekel Scientific，目录号：260350）
SpectraMax MiniMax ^{TM 300成像细胞仪（Molecular Devices，型号：SpectraMax MiniMax 300）}

软件

FlowJo 9.9或永不（Tree Star）

程序

在HEK293T细胞中产生含有病毒颗粒的shRNA
注意：在HEK293T细胞中磷酸钙转染后产生HIV-1颗粒
1. HEK293T细胞培养
  1. 将HEK293T细胞在含有35ml培养基的175cm 2组织培养瓶中的DMEM培养基（补充有10％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素）中培养。
  2. 为了维持HEK293T培养细胞，当接近汇合（〜80％）时，用PBS洗涤两次，然后胰蛋白酶消化（0.05％胰蛋白酶），并在175cm 2组织培养物中1/10稀释后铺板瓶。 HEK293T细胞每2-3天分裂一次
  3. 在转染前一天，在10ml培养基中每10cm皿平板约2×10 6个HEK293T细胞。
    注意：解冻冷冻细胞小瓶后，将HEK293T细胞培养至少一周，然后转染它们进行病毒生产。为了使病毒颗粒生产最大化，HEK293T细胞在培养中从未保存超过4周
2. 磷酸钙转染
  注意：描述了用于转染一个10cm皿的方案。
  1. 从盘中取出2ml培养基。
  2. 加入8μl25mM氯喹，终浓度为25μM，孵育约5分钟，然后加入DNA / CaCl 2 混合物。
  3. 在15ml锥形管（10μg含有载体，6.5μg包装构建体pCMVdelta R8.91和3.5μgVSV-G糖蛋白的载体）中，在无核酸酶的H 2 O 2中制备DNA混合物，。
  4. 向DNA混合物中加入无核酸酶H 2 O 2，最终体积为876μl。
  5. 加入1 ml 2x HBSS缓冲液。
  6. 慢慢地（滴加）向稀释的DNA中加入124μl2M CaCl 2。
  7. 加入CaCl 2后，在最低设置下轻轻涡旋5秒（注意：不要旋转下来！），并立即将制备的DNA溶液逐滴添加到细胞中在10厘米的盘子里
  8. 旋转平板以平均分配溶液。
  9. 在37°C培养3-4小时。
  10. 去除上清液
  11. 加入1毫升甘油休克溶液，冲击1分钟。
    注意：加入甘油导致渗透性休克，并被认为会导致DNA从沉淀物的释放（Grosjean等，2006）。
  12. 吸出冲击溶液，在1ml DMEM培养基（补充10％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素）中洗涤细胞并再次吸出。
  13. 加入7ml DMEM（补充10％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素）培养基。
  14. 转染后48 h，用10ml注射器收集上清液，并通过无菌0.45μmPVDF膜过滤器过滤
  15. 根据制造商的说明书，使用Lenti-X ^{TM p24快速滴定试剂盒对p24含量的滴度病毒。}
  16. 过滤的病毒上清液可以新鲜使用或储存在-80°C
具有含有病毒颗粒的shRNA的A2和A72 J-Lat细胞的旋转感染注意：A2和A72细胞被旋转感染感染。
1. A2和A72 J-Lat悬浮细胞培养
  1. 将A2和A72细胞在40ml培养基中的75cm 2组织培养瓶中的RPMI培养基（补充有10％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素）中培养。将烧瓶水平放置以增加细胞生长的表面积。
  2. 细胞每1-2天分裂一次，并应保持浓度为2×10 5〜15×10 -6 / ml。
  3. 转染前一天，将A2或A72细胞分裂至5×10 5 / ml
2. 感染A2和A72 J-Lat细胞
  1. 用新的RPMI培养基（补充10％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素）计数细胞并调节细胞数。将A2或A72细胞中加入1×10 6个/ ml以上的微量离心管。
  2. 以300×g离心细胞悬液3分钟（1,800rpm）。彻底取出上清液。
  3. 在1.7ml微量离心管中加入500μlshRNA病毒（每10μl6μg细胞1ng p24），5μl1M HEPES和0.5μl聚凝胺（4μg/ ml）。
  4. 在32℃下以1,341 x g（2,400rpm）离心（台式离心机，Beckman）在32℃离心1.5小时。
  5. 彻底清除上清液。
  6. 在6孔组织培养板中将细胞重悬于3ml RPMI培养基（补充有10％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素）中。
  7. 在37℃的CO 2培养箱中培养一天。
  8. 如果shRNA病毒颗粒含有嘌呤霉素抗性基因，则选择含2μg/ ml嘌呤霉素RPMI培养基的细胞。使用嘌呤霉素的RPMI培养基（补充有10％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素）每两天更换一次。取决于细胞生长的速度以及其它实验（例如，染色质免疫沉淀，RNA分离等）所需要的细胞可以通过每2天加入培养基而生长，并移至较大的培养瓶或分裂培养它们在6孔板。
  9. 在CO 2培养箱中37℃培养4-10天
通过流式细胞术分析HIV-1 LTR转录激活（请参见生物学协议：Boehm and Ott，2017）
1. 计数单元格并用新介质调整单元格编号。将约2×10 5个/孔的A2或A72细胞铺在96孔组织培养板中的195μlRPMI培养基（补充有10％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素）。每个条件执行三次重复。
2. 用0.016-10ng / mlTNFα（作为用于最大活化的共同刺激或检查协同作用），PBS或H 2 O对照（取决于用作TNFα的稀释剂）来治疗细胞），或未经处理。将TNFα和对照物以5μl的量移液以达到200μl/孔的总体积。通过上下移动将细胞和TNFα混合至少3次
3. 在CO 2培养箱中在37℃培养18-48小时。
4. 从培养箱取板，并在室温下以1341 x g（2,400 rpm）（台式离心机，Beckman）离心2分钟。
5. 然后直接进行流式细胞分析。细胞不必被洗涤或固定。
  注意：
  1. 对于流式细胞术，使用MACSQuant VYB FACS分析仪来运行96孔板。然而，其他流式细胞仪如Calibur或LSRII也适用于这些实验。
  2. 如果通过前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）的细胞活力的分析不足以准确评估药物研究中的药物毒性，则是各种染料/污渍之一;例如7AAD，碘化丙啶或其中一种Zombie活性染料可以按照本协议流程细胞分析中的制造商说明使用。
6. 使用SpectraMax MiniMax 300成像细胞仪，根据制造商的说明书，使用ApoTox-Glo Triplex Assay（Promega）测量活力，细胞毒性和细胞凋亡。
通过SDS-PAGE和Western blot确定shRNA敲低效率 SDS-PAGE和Western印迹方案在其他地方描述（Renart等人，1979; Towbin等人，1979）。
1. 在1.7ml微量离心管中的100-500μlRIPA缓冲液中的Lyse 1×10 6细胞。
2. 根据制造商的说明书，使用SpectraMax MiniMax 300成像细胞仪测量DC ^{TM蛋白质测定蛋白质浓度（Bio-Rad Laboratories）。}
3. 在一条泳道中加载PageRuler蛋白梯子，另一条泳道在6-15％SDS凝胶上从细胞裂解液中等量的蛋白质（取决于蛋白质的大小），并在200V下电泳1 h分离蛋白质。每个蛋白质的kDa的预期大小和丙烯酰胺的适当百分比是：BRD2,110kDa，8％; BRD4,171kDa，6.5％;细胞周期蛋白T1，87 kDa，8％; α-微管蛋白，50kDa，10％。由于蛋白质的kDa是如此不同，所以可以通过与α-微管蛋白抗体孵育来切割膜以检查相等的载量。
4. 使用Bio-Rad Mini-PROTEAN电泳系统在100 mA下将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上1-3小时或在35 mA下过夜（对于大于120 kDa的蛋白质）。 />
5. 阻止在含有5％脱脂奶粉（封闭缓冲液）的TBS-T中的转移蛋白质在室温下摇摆。
6. 在TBS-T缓冲液中，在摇床上4℃下，用一级抗体（BRD2 1:100; BRD41μg/ ml;细胞周期蛋白T1：1,000;α-微管蛋白1：2,000）孵育该膜。 >
7. 每次用TBS-T缓冲液洗涤膜约3分钟约5分钟，并在室温下在摇床上与在TBS-T缓冲液中以1:10,000稀释的HRP缀合的二抗体孵育1小时。
8. 每次用TBS-T缓冲液洗涤膜三次约5分钟，并在Lumi-light Western印迹底物中孵育30秒。
9. 在化学发光膜上进行显影，将膜暴露10秒钟至30分钟。取决于抗体是否已被重复使用，并且多次被重复使用，信号将显得更弱，但更清洁（较少的背景带）。

数据分析

通过流式细胞术分析HIV-1 LTR转录激活（图1）

图1. BRD2，BRD4，细胞周期蛋白T1和α-微管蛋白的蛋白质印迹A.用针对BRD2，BRD4或非靶向加扰对照的含有shRNA构建体的病毒感染A72细胞。在感染后4天，收获细胞并在Ripa缓冲液中裂解。通过用BRD2和BRD4抗体或对照α-微管蛋白的免疫印迹证实BRD2和BRD4蛋白水平的敲低。 B.用靶向细胞周期蛋白T1或非靶向对照的含有shRNA构建体的病毒感染A72细胞。细胞周期蛋白T1蛋白水平的敲低通过用细胞周期蛋白T1或对照α-微管蛋白抗体进行免疫印迹来显示。

首先，在活的J-Lat细胞上设置门。通过正向（FSC区域）和侧向散射（SSC-Area）分析（图2A）监测细胞活力。
单刀闸（FSC-Height vs. FSC-Area）（图2B）
在SSC-Area和GFP / FITC-Area上设置门，以识别GFP ^{+ 单元格的数量（图2C）。}
每个样品通常一式三份分析，实验独立重复三次。通过计算（GFP ^{+ 细胞实验1 + GFP ^{+ 细胞实验2 + GFP ^{+ 细胞实验3）/ 3来平均三个重复。还计算误差条的标准偏差（STDEV）。

图2.通过流式细胞术分析HIV-1 LTR转录激活分析A2或A72 J-Lat细胞的门控策略：A.基于大小（FSC区域）对活J-Lat细胞门控）和粒度（SSC-Area）; B.单闸门（FSC-Height vs. FSC-Area）; C.Gate on GFP ^{+ J-Lat细胞（SSC-Area vs.GFP-FITC-Area）。}}}}

食谱

25毫克氯喹
25毫克氯喹在PBS中
2x HBSS
50 mM HEPES
10 mM KCl
12mM葡萄糖
280 mM NaCl
1.5mM Na 2 HPO 4
调节pH到7.1
注意：pH值至关重要！
2 M CaCl 2
不含核酸酶的H 2 O 2中的2M CaCl 2
甘油冲击液
150 nM NaCl
20mM HEPES，pH 7.0
15％甘油
聚凝胺溶液
4毫克/毫升无核酸酶H 2 O O
RIPA缓冲区
50mM Tris缓冲液，pH 7.4 1％NP-40
0.5％脱氧胆酸钠
0.1％SDS
150 mM NaCl
2 mM EDTA
50毫克氟化钠
蛋白质印迹运行缓冲液
25 mM Trizma ^{® base
190mM甘氨酸
0.1％SDS}
蛋白质印迹转移缓冲液（pH 8.3）
25 mM Trizma ^{® base
190mM甘氨酸
20％甲醇}
TBS-T缓冲区
19 mM Trizma ^{® base
2.7 mM氯化钾
137 mM氯化钠
1 ml吐温^{® 20}}

致谢

我们感谢Marielle Cavrois和流式细胞术核心为流式细胞术提供的服务。加利福尼亚大学旧金山Gladstone病毒学研究所的帮助下，这本出版物成为可能。艾滋病研究免疫中心（CFAR），NIH资助计划（P30 AI027763）。这项研究得到了amfAR艾滋病毒治疗研究所的一部分的支持，该研究所获得了来自amfAR拨款109301的资助。此外，我们非常感谢加州艾滋病研究项目（F13-GI-316）获得DB支持，与JT Pharma的行业赞助合作，启用了shRNA筛选MO，并向CARE协作机构（U19 AI096113）和NIH（RO1 AI083139和RO1 DA043142）向MO提供支持该协议从以前的工作改编：“BET溴结构域靶向化合物通过Tat独立机制从延迟重新激活HIV”（Boehm等人，2013）

参考

Boehm，D.，Calvanese，V.，Dar，RD，Xing，S.，Schroeder，S.，Martins，L.，Aull，K.，Li，PC，Planelles，V.，Bradner，JE，Zhou，MM ，Siliciano，RF，Weinberger，L.，Verdin，E。和Ott，M。（2013）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov / pubmed / 23255218“target =”_ blank“> BET溴结构域靶向化合物通过Tat无关机制从延迟中重新激活HIV。细胞周期 12（3）：452-462。 br />
Boehm，D.和Ott，M.（2017）。 A2和A72 J-Lat细胞系中药物诱导的HIV-1转录活性的流式细胞术分析。 7（10）：e2290。

Dawson，MA，Prinjha，RK，Dittmann，A.，Giotopoulos，G.，Bantscheff，M.，Chan，WI，Robson，SC，Chung，CW，Hopf，C.，Savitski，MM，Huthmacher，C.，Gudgin ，E.，Lugo，D.，Beinke，S.，Chapman，TD，Roberts，EJ，Soden，PE，Auger，KR，Mirguet，O.，Doehner，K.，Delwel，R.，Burnett，AK，Jeffrey ，P.，Drewes，G.，Lee，K.，Huntly，BJ和Kouzarides，T。（2011）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：//www.ncbi.nlm。 nih.gov/pubmed/21964340“target =”_ blank“>抑制作为MLL融合白血病的有效治疗的染色质的BET招募自然 478（7370）：529-533 。

Deeks，SG（2012）。艾滋病毒：冲击和杀死自然 487（7408）：439-440。

Delmore，JE，Issa，GC，Lemieux，ME，Rahl，PB，Shi，J.，Jacobs，HM，Kastritis，E.，Gilpatrick，T.，Paranal，RM，Qi，J.，Chesi，M.，Schinzel ，AC，McKeown，MR，Heffernan，TP，Vakoc，CR，Bergsagel，PL，Ghobrial，IM，Richardson，PG，Young，RA，Hahn，WC，Anderson，KC，Kung，AL，Bradner，JE和Mitsiades，CS （2011）。 BET溴结构域抑制作为治疗策略目标c-Myc。细胞 146（6）：904-917。

Filippakopoulos，P.，Qi，J.，Picaud，S.，Shen，Y.，Smith，WB，Fedorov，O.，Morse，EM，Keates，T.，Hickman，TT，Felletar，I.，Philpott，M ，Munro，S.，McKeown，MR，Wang，Y.，Christie，AL，West，N.，Cameron，MJ，Schwartz，B.，Heightman，TD，La Thangue，N.，French，CA，Wiest， O.，Kung，AL，Knapp，S.and Bradner，JE（2010）。＆nbsp; 选择性抑制BET溴结构域。自然 468（7327）：1067-1073。

Finzi，D.，Blankson，J.，Siliciano，JD，Margolick，JB，Chadwick，K.，Pierson，T.，Smith，K.，Lisziewicz，J.，Lori，F.，Flexner，C.，Quinn， TC，Chaisson，RE，Rosenberg，E.，Walker，B.，Gange，S.，Gallant，J.and Siliciano，RF（1999）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10229227“target =”_ blank“> CD4 ^{+ T细胞的潜在感染为HIV-1的终身持续存在提供了机制，即使在有效的联合治疗。 Nat Med 5（5）：512-517。}

Grosjean，F.，Bertschinger，M.，Hacker，DL和Wurm，FM（2006）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed / 17009090“target =”_ blank“>多重甘油休克增加非同步CHO细胞的磷酸钙转染。生物技术生物技术28（22）：1827-1833。

约旦，A.，Bisgrove，D.和Verdin，E.（2003）。＆nbsp; HIV可重复地在体外T细胞急性感染后建立潜伏感染。 22（8）：1868-1877。

约旦，A.，Defechereux，P.和Verdin，E.（2001）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11285236”目标=“_ blank”>人类基因组中HIV-1整合的位点决定了基因转录活性和对Tat转录激活的反应。 20（7）：1726-1738。 br />

Naldini，L.，Blomer，U.，Gallay，P.，Ory，D.，Mulligan，R.，Gage，FH，Verma，IM and Trono，D。（1996）。＆lt; a class =插入文件“href =”http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8602510“target =”_ blank“> 体内通过慢病毒载体的非分裂细胞的基因递送和稳定转导。科学 272（5259）：263-267。

Nicodeme，E.，Jeffrey，KL，Schaefer，U.，Beinke，S.，Dewell，S.，Chung，CW，Chandwani，R.，Marazzi，I.，Wilson，P.，Coste，H.，White， J.，Kirilovsky，J.，Rice，CM，Lora，JM，Prinjha，RK，Lee，K.and Tarakhovsky，A。（2010）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21068722“target =”_ blank“>通过合成组蛋白模拟物抑制炎症。自然 468（7327）：1119-1123 。

Renart，J.，Reiser，J. and Stark，GR（1979）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/91164”target蛋白质从凝胶转移到重氮苄氧基甲基纸上，用抗血清检测：用于研究抗体特异性和抗原结构的方法。美国Proc Natl Acad Sci USA 76（7）： 3116-3120。

Sedaghat，AR，Siliciano，JD，Brennan，TP，Wilke，CO和Siliciano，RF（2007）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov / pubmed / 17784786“target =”_ blank“>在HAART患者中用于HIV的静息CD4 ^{+ T细胞库的补充限制 PLoS Pathog 3 （8）：e122。}

Towbin，H.，Staehelin，T.和Gordon，J。（1979）。蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶到硝酸纤维素片的电泳转移：程序和一些应用。美国Proc Natl Acad Sci USA 76（9）：4350-4354。 >

Zhang，G.，Liu，R.，Zhong，Y.，Plotnikov，AN，Zhang，W.，Zeng，L.，Rusinova，E.，Gerona-Nevarro，G.，Moshkina，N.，Joshua，J. ，Chuang，PY，Ohlmeyer，M.，He，JC and Zhou，MM（2012）。＆nbsp; BRD4抑制在HIV相关肾脏疾病中NF-κB转录活性的下调。 J Biol Chem 287（34）：28840-28851 。