注意：板上的ELISPOTS可以在夹层显微镜或立体显微镜下手动计数（例如，Greenough，高性能变焦立体显微镜，SMZ 168系列）。或者，有几个专门的高通量筛选自动化系统（AELVIS，Autoimmun Diagnostika，Bio-Sys，Cellular Technology和Zeiss reader），其他地方讨论的优缺点超出了本协议的范围（Janetzki et al。，2015 ）。

垃圾箱
Gilson移液器和提示：P-2，P-10，P-20，P200，P1000
Gilson多通道移液器与匹配的提示
Beckman Allegra 12冷冻离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-12）
II类生物危害罩
孵化器
1升瓶子

程序

有两种测量细胞类型特异性反应的方法。首先，分离总CD4 + / sup和/或CD8 + sup细胞并用树突状细胞（DC）和所选择的肽（Karunarathne等人。，2016）。 T细胞通常使用珠基技术如Dynabeads磁珠（Untouched Mouse T cells kit; Life Technologies，US）或Miltenyi Biotec（CD90.2T细胞分离;德国）从实验小鼠中富集。 DC使用抗小鼠CD11c Microbeads（Miltenyi Biotec; Germany）与幼稚小鼠（用作抗原呈递细胞; APC）免疫磁性分离。 DC不应与已知DC功能受损的实验小鼠分离。也可以使用基于流式细胞术的细胞分选来分离细胞类型（T细胞和DC）。来自各个小鼠的约2×10 5个T细胞应与2×10 4个DC共培养，每个样品的4-8个重复孔中，20μg/ ml肽，重组蛋白或无肽，如前所述（Howland等人，2013）。或者，如果肽对CD4 + T细胞而言不是特异性的，反之亦然，则可以使用没有额外的DC或具有DC的总T细胞的总脾细胞。然后将这些组合的细胞与特异性肽在用抗-IFN-γ抗体包被的ELISPOT平板上培养。 ELISPOT板上的IFN-γ特异性抗体从细胞分泌后立即捕获IFN-γ。对于人T细胞，含有APC和T细胞的总PBMC与选择的肽一起培养。对于阳性对照，只需将PHA添加到总细胞或没有DC的分离的T细胞。

第1天
1. 涂覆缓冲液稀释一次抗体的多层HTS薄膜-IP板：
  在用抗体涂覆板之前，用15μl70％乙醇（Milli-Q水）将每个孔中的膜加湿1分钟。在乙醇蒸发之前用150μl无菌PBS冲洗3次。然后用无菌涂层缓冲液中的50μl抗-IFNγ抗体（捕获）涂覆平板。在4℃下孵育过夜。
  注意：
  1. 板可以在使用前一周涂覆，但必须储存在潮湿条件下（例如，用无菌水或PBS中浸湿的组织的盒子）。
  2. 涂有抗体的孔数应考虑下列所有对照和每个样品至少4-8个重复孔。
  3. 如果可能，建议对重复的细胞编号（图1）进行滴定，以确保计数细胞的最佳范围。
  4. 确保叠氮化钠不会添加到任何缓冲液中，任何步骤都会停止辣根过氧化物酶活性。
    
    图1. ELISPOT测定的代表性实例。从阴性和阳性对照和2个测试样品中滴定细胞数。测试1显示没有稀释滴定，因此细胞数量与阴性对照相似。测试2具有下降的细胞数，滴定指示IFN-γ分泌细胞。
2. 以下对照孔应纳入试验：
  1. 无抗原刺激（DC和T细胞培养无肽）
  2. 淋巴细胞有丝分裂原阳性对照（T细胞无DC，但有丝分裂原如PHA为5-10μg/ ml）。
  3. 没有细胞;无一抗
第2天
1. 阻塞膜与阻塞溶液
  1. 取出一抗溶液
  2. 用150μl无菌PBS /孔冲洗未结合的抗体，至少两次。
  3. 将细胞培养基（参见食谱）每孔150μl的阻断膜在37℃下至少2小时。
    注意：如果介质变粉红色，直到橙色，请继续更换。
2. 准备小鼠脾细胞（MacPherson等人，2001; Wykes等人，2007），或分离悬浮在细胞培养基中的T细胞/ DC（参见食谱）。计划每个样本有4-8个重复井。
  1. 对于使用总脾细胞或PBMC的测定，将细胞重悬于细胞培养基中，终浓度范围为2×10 6至6×10 6细胞/ ml，用于在1×10 5至3×10 5个脾细胞或每个孔的PBMC的可能测试范围。
  2. 分离的T细胞通常以4×10 6个细胞/ ml重悬浮，用于测试用2×10 4个DC / DC培养的2×10 5个细胞每口
    注意：所需的细胞浓度取决于免疫应答的强度。如果预期的反应未知，建议连续稀释细胞浓度。
  3. 在最终含有重组IL2（60U / ml）的培养基中将抗原稀释（20μg/ ml）
3. 细胞刺激
  1. 放弃阻挡介质。
  2. 加入50μl细胞悬浮液和50μl每孔稀释的肽（抗原）（最终体积：100μl/孔，对应于抗原为10μg/ ml，重组IL2为30U / ml）。
    注意：为了最大限度地减少井的播种，建议不要添加超过3×10 ^{5 细胞/孔。}
  3. 在37℃，5％CO 2，95％湿度下孵育18至24小时。
    注意：细胞培养时不要移动板。这将导致“蜗牛径”点不明确。如果您有不止一个以防止边缘效应，请不要堆叠板。
第3天
1. 二抗
  1. 用细胞去除培养基
  2. 用PBS洗涤板3次，PBS / 0.01％吐温20洗3次注意：确保在洗涤缓冲液中加入吐温20。一些细胞在培养过夜后已经开始附着。吐温20将有助于将其从膜上清洗掉。如果可用，请勿在此阶段使用洗板机。
  3. 在PBS / 0.5％BSA中稀释生物素化的抗-γγ抗体（检测）。将样品通过0.45μM或0.22μM过滤器去除聚集体。一些样品将通过过滤而丢失，原始体积必须相应地缩小。每孔加入50μl检测抗体注意：由于蛋白质聚集，未能过滤二抗可能导致非特异性点形成。
  4. 在37℃，5％CO 2，95％湿度下孵育2小时。
  5. 然后在4℃下孵育过夜，在密封的盒子里，用无菌水或PBS湿润的组织湿润。
第4天
1. 用PBS / 0.01％吐温20洗涤板6次。
2. 酶结合物和底物发育
  1. 在PBS中制备链霉抗生物素蛋白 - 辣根过氧化物酶稀释液
  2. 每孔加入50μl链霉抗生物素蛋白 - 辣根过氧化物酶。在室温下孵育45分钟。
    注意：用酶偶联物孵育超过1小时可能会导致背景颜色增加。
  3. 去除链霉亲和素溶液，用PBS / 0.01％吐温20洗涤3次，然后用PBS洗涤3次。
    注意：
    1. 只有PBS的最后洗涤是重要的，因为吐温20会干扰现场发展。
    2. 塑料底座应从板的底部取下，以便在加入基质/色原体之前彻底清洗膜。例如，在与链霉抗生物素蛋白辣根过氧化物酶缀合物孵育后，除去碱并在运行的蒸馏水下洗涤膜的两侧。这有助于防止高背景，因为一些试剂可能通过膜泄漏到板的底部托盘中。
  4. 加入75μl/孔AEC底物（经过0.45μM或0.22μM过滤）。在黑暗中孵育5分钟（铝箔或抽屉内），然后检查斑点。如果斑点不清楚，请再次孵育并定期检查。当斑点清晰可见但背景膜颜色变得太暗并且斑点和膜颜色之间的对比度丢失时，停止斑点发育。
    注意：优化底物开发的时间至关重要。发展时间可能会有所不同。过度开发将导致背景增加。
  5. 停止现场开发使用自来水和洗涤广泛。洗涤时，取出底板，继续冲洗。
  6. 将板彻底压到吸收性纸巾上。
  7. 让板在黑暗中一夜之间干燥。曝光时光斑强度可能会下降。
    注意：如果膜过夜储存，斑点可能会变得更加尖锐。如果储存，将膜包裹在箔中。

数据分析

斑点计数在解剖显微镜或自动ELISPOT阅读器中，并计算分泌细胞的频率：
一个单元格=一个点
斑数=分泌细胞因子的细胞数量
斑点的强度和大小=细胞的相对细胞因子分泌能力
背景减法
对于ELISPOT数据分析，从测量结果中减去背景值。每个样本组应具有单个背景斑点平均值/中值，由阴性对照（T细胞和没有抗原的DC）计算。然后对于样品中的每个抗原组，计算组的平均值/中位数，然后减去背景平均值/中值，并通过每孔的细胞数归一化计数。
测定
1. 积极应该是＆gt; 50个点/ 10个/ 6个细胞。
2. 阴性对照应理想地为0个/ 10个细胞。如果＆gt; 0和＆lt; 50个/ 10个细胞，从测试计数中减去阴性对照，校正背景染色。如果＆gt; 50个/ 10个细胞，重复测定。
3. 污染：
  1. 如果一个测定条件的一个重复孔清楚地显示为污染，则忽略该特定孔，并使用其他孔的结果。
  2. 如果多个井清楚地被污染，重复测定。
结果
对于每种测试抗原，结果报告为用于人PBMC或SFC /脾的小鼠脾细胞的斑点形成细胞（SFC）/百万。

笔记

由于辣根过氧化物酶活性被叠氮化钠完全停止，请确保其不会添加到与此测定相关的任何缓冲液或试剂中。
有几个品牌的抗体可用，适用于此测定，甚至可以作为抗体对购买。然而，每个新的抗体小瓶应在棋盘滴定中进行测试以确定最佳稀释度（Asai，2000＃14220）。

食谱

无菌磷酸缓冲盐水（1x PBS）
开始用800毫升蒸馏水，加入8克NaCl; 0.2克KCl; 1.44g的Na 2 HPO 4和0.24g的KH 2 PO 4 用HCl将pH调节至7.4 加入蒸馏水至1L的总体积库存储存为1 L瓶
在室温下存放
涂层缓冲液工作溶液（0.5M碳酸氢盐 - 碳酸氢盐缓冲液pH9.6） 3.7g NaHCO 3和0.6g Na 2 CO 3（无水），用蒸馏水补足至100ml 100ml / 通过轻轻混合碳酸盐碳酸氢盐溶解，直到没有留下粉末残留物，并用0.22μM过滤器进行过滤器
检查pH应为〜9.6，偶尔需要调整
在室温下存放在黑暗中
阻塞解决方案
IMDM培养基
10％胎牛血清
1％青霉素 - 链霉素
0.1％β-巯基乙醇
抗IFN-γ捕获工作解决方案
这是捕获抗体。在涂布井前立即准备。每个孔需要50μl，按制造商的浓度或每种抗体库存的滴定量
生物素 - 抗IFN-γ工作液
这是检测抗体。准备像PBS一样。每个孔需要50μl，按制造商的浓度或每种抗体库存的滴定量
链霉亲和素 - 辣根过氧化物酶工作溶液
准备PBS中的稀释液。每个孔需要50μl，按制造商的浓度或每种抗体库存的滴定量
吐温20工作方案
加入0.5ml吐温20储备液至1,000ml 1x PBS 在室温下存放
10％胎牛血清在IMDM培养基中（在4℃暗处存储）
1. 胎牛血清库存
  解冻并分配到50ml等分试样中。储存于-20°C
2. IMDM培养基（在黑暗中存储在4℃）
3. L-谷氨酰胺库存
  以200mM浓度提供为50ml。储存于-20°C
  根据随后要制备的培养基的体积，解冻并分配成1或5ml等分试样。储存于-20°C，黑暗中直至需要
4. 青霉素 - 链霉素（5,000 U / ml）
  以5,000U / ml浓度提供为100ml。储存于-20°C
  根据随后要制备的培养基的体积，解冻并分配成1或5ml等分试样。储存于-20°C，黑暗中直至需要
5. 10％胎牛血清在IMDM培养基（完全培养基）中对于100ml：加入10ml FCS（a），1ml L-谷氨酰胺（c），1ml青霉素 - 链霉素（d），100μlβ-巯基乙醇和88ml IMDM（b）。在黑暗中储存4°C
PHA库存解决方案
加入10ml PBS至浓度为500μg/ ml的PHA粉末等分并冷冻10μl体积。储存于-80°C
注意：
1. 不要重新冻结解冻的PHA。
2. 以5mg纯化的无盐冻干粉末提供PHA（凝集素，阳性对照）原料。
3. 在测定中，使用终浓度为5-10μg/ ml。向含有100μl体积的细胞的每个孔中加入1-2μl储备溶液

致谢

MNW得到ARC Future Fellowship和NHMRC的支持。 L.R.得到新加坡A * STAR和NRF新加坡（NRF2007NRF-RF001-226）的支持。作者希望感谢Josh Horne-Debets先生的ELISPOT形象。
ELISPOT方法最初是用于检测来自B细胞的抗原特异性抗体（Czerkinsky等人，1983），并且多年来被几组修饰以检测由抗原特异性细胞产生的细胞因子。

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