材料和试剂

1,000μl移液器吸头（Corning，Axygen ^®，目录号：T-1000-B）
20 x 10厘米信封
50ml管（Corning，目录号：430829）
60 x 15毫米培养皿（康宁，目录号：430196）
150 x 25毫米培养皿（康宁，目录号：430599）
纱布
10ml管（Biosharp，目录号：BS-100-M）
100μm细胞过滤器（Corning，Falcon ^{®，目录号：352360）}
2 ml微管（SARSTEDT，目录号：72.694.005）
4 ml超速离心管（Beckman Coulter，目录号：355603）
26.3ml超速离心管（Beckman Coulter，目录号：355654）
百合成熟花粉根据Han等人收获。（2010）
根据Dai等人（2007）
收获水稻成熟花粉
硼酸（H 3 O 3 BO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：B9645）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C2661）
注意：本产品已停产。
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S7903）
硝酸钙四水合物，Ca（NO 3 3）2·4H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C1396）
盐酸硫胺素（VB 1）（Sigma-Aldrich，目录号：T4625）
聚（乙二醇），平均M n 4 000（PEG 4000）（Sigma-Aldrich，目录号：81240）
3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）（Sigma-Aldrich，目录号：M1254）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
cOmplete，不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Roche Diagnostics，目录号：04693132001）
L-抗坏血酸（VC）（Sigma-Aldrich，目录号：A7506）
聚（乙烯基聚吡咯烷酮）（PVPP）（Sigma-Aldrich，目录号：77627）
磷酸三钾（K 3 3 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5629）
聚乙二醇，平均摩尔重量3350（PEG 3350）（Sigma-Aldrich，目录号：P4338）
葡聚糖T-500（Pharmacia，目录号：17-0320-01）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S7795）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A1933）
百合花粉萌发培养基（见食谱）
水稻花粉发芽培养基（见食谱）
均质缓冲液（见配方）
血浆膜隔离缓冲液（见配方）
水性聚合物两相体系（见配方）
稀释缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液（见配方）

设备

移液器（Gilson，型号：P1000N）
涡流
平衡
离心机（Beckman Coulter，型号：J2-HS）
均质器（MP Biomedicals，型号：FastPrep -24）
超离心机（Beckman Coulter，型号：Optimal ^TM L-80XP）
具有5x和10x物镜的显微镜（Carl Zeiss，型号：Axio Imager 1）

软件

ZEN lite软件（2012，蓝版）

程序

成熟花粉收集
1. 当花药开裂时，使用20 x 10厘米信封收集中午（11:00 AM-1：00 PM）的成熟花粉（MPG）。
2. 将MPG转移至50ml管。
3. 立即使用MPG或添加异位硅胶，然后存放在-80°C。
体外花粉萌发
萌发的起始程序对于百合和水稻花粉是不同的。对于百合花粉，应该进行预处理，以清除厚的脂质外套，而薄壁的水稻花粉不需要这种洗涤。
1. 百合百合花粉发芽
  注意：此过程已从Ren等人修改。（1998）和Prado等人（2004）。
  1. 将-80°C储存的MPG在黑暗中转移至-20°C，持续2周，然后再进行萌发。
  2. 将0.5g MPG放入黑暗，潮湿的环境中，在4℃下持续10小时
  注意：黑暗，潮湿的环境如下定制：将MPG放入培养皿（60 x 15 mm）（图1A）中，用纱布覆盖（图1B），然后将其放入较大的培养皿（150×25mm）和50ml ddH 2 O（图1C）。这种安排只允许与ddH O进行纱布接触，不要让MPG直接与ddH _{2接触。
  
  图1.设置潮湿环境。 A.将0.5 g百合MPG放入60 x 15 mm培养皿中; B.用四层纱布覆盖培养皿; C.将B组放入具有50ml ddH 2 O的150×25mm培养皿中。}
  1. 在10ml管中用5ml发芽培养基洗涤MPG两次，并在室温下以4,500×g离心5分钟后弃去流经。
  2. 将洗涤的MPG（图2A）放入培养皿（60×15mm）的100ml发芽培养基中，然后在28℃下在黑暗中孵育2小时，以75rpm/min的温和振荡。 >
    
    图2. Lilium davidii 和 Oryza sativa MPGs和GPG。 A.百合药物 MPGs; B.Lilium davidii 体外的MPGs发芽2小时; ;; sat;;;;;;;;;;;;;豌豆sat iva sat sat>> g g g。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。棒=50μm。
  3. 使用5x目标的显微镜观察发芽率，确保发芽率大于90％，花粉管长约500μm（图2B）。
  4. 通过使用100μm的细胞过滤器收集发芽的花粉粒（GPG），丢弃含有未发芽的MPG的流通。
  5. 立即使用GPG或储存（将过滤器保留的质量转移至50ml管，不要添加任何溶液）-80°C。
2. 花粉萌发注意：此过程由Dai等人修改（2007）。
  1. 将0.5g新鲜收集的MPG（图2C）立即放入培养皿中的100ml发芽培养基中，并在室温下轻轻振荡培养约15分钟。
    注意：水稻MPG必须新鲜收集，否则，将失去萌发的活动。
  2. 使用具有10x目标的显微镜观察以获得同步发芽的花粉管（图2D）注意：如果花粉发芽不同步，或发芽率低于80％，则不应将该物质用于GPGs蛋白质组学分析。
  3. 通过在4℃，1,000×g，5分钟离心收集GPG。
  4. 立即使用GPG或储存于-80°C。
微粒体囊泡分离
1. 使用6ml匀浆缓冲液将0.5g花粉（MPG或GPG）悬浮在50ml烧杯中，然后将悬浮液转移到等体积的三个2ml微管中。
  注意：在开始步骤C1之前，应将L1ily MPG洗涤为步骤B1c。
2. 以6.5米/秒的速度使用FastPrep -24，将2毫升微管中的花粉均质化120秒。
  注意：对于水稻花粉，使用6.5米/秒的速度30秒就可以了。
3. 将悬浮液在4℃，1,500×g离心5分钟以除去细胞碎片，然后将上清液转移到新管中。
4. 将得到的上清液在4℃离心12,000×g 20分钟以除去线粒体，然后将上清液转移到新管中。
5. 将所得上清液在4℃，31,000μg/g下离心15分钟以除去其它细胞器污染物，然后将上清液转移到超速离心管中。
6. 将所得上清液在4℃，100,000xg下超速离心1小时，得到的颗粒是总微粒体囊泡（MSV）。
血浆膜富集
水性聚合物两相体系是富集质膜的有效工具以下协议是按照辛德勒和诺华王（2006）的原则设计的。
1. 将MSVs悬浮于1.2ml质膜（PM）隔离缓冲液中
2. 将1.0g悬浮的MSV放入8.0g含水聚合物两相体系中，通过涡旋混合，然后在4℃，4,200×g离心30分钟。
  注意：通过使用电子天平制备含水聚合物两相体系，因为组分PEG 3350和葡聚糖T-500的浓度是质量比（参见食谱）。
3. 将3.0ml顶层转移到另一个8.0g水性聚合物两相体系中，混合，然后在4℃，4,200×g离心30分钟。
4. 重复步骤D3一次。
5. 将3.0ml的顶层转移到超速离心管中，用稀释缓冲液稀释3-5倍，在4℃离心20,000×g 1小时。所得颗粒为PM泡
6. 用50μl稀释缓冲液悬浮所得的小丸，立即使用，或将此悬浮液储存于-80°C
血浆膜纯化
碱性溶液可以将PM泡沫层改为PM片，以去除嵌入的细胞质。以下方案主要根据Fujiki等人（1982）。
1. 用洗涤缓冲液稀释PM泡，蛋白浓度为0.02〜1.00μg/μl
2. 保持在冰浴中30分钟，每10分钟偶尔会涡旋
3. 在4℃，50,000×g离心1小时。排出上清液，得到的颗粒是纯化的PM。
4. 用冷的ddH 2 O 2轻轻洗涤纯化的PM颗粒，不要悬浮颗粒，然后丢弃ddH 2 O。
  注意：通常，从0.5g花粉开始可以得到约20μg纯化的PM蛋白。它们的纯度可以通过蛋白质印迹通过使用用于PM特异性P型H +的抗体和一些细胞器特异性蛋白质，例如作为核蛋白组蛋白H1。
5. 立即使用纯化的PM或将颗粒储存在-80°C。

数据分析

使用直立光学显微镜（Axio Imager 1，Carl Zeiss，Germany）和ZEN lite软件（2012，蓝版）获得百合和稻萌发花粉的数字图像。

笔记

不要使花粉过度均匀化。太多的细胞碎片会降低水性聚合物两相体系的质膜纯化能力。在显微镜下观察到80％花粉（10个花粉中有8个）被破坏时，均匀化将很好。

食谱

注意：使用MilliQ水制备以下溶液，不需要通过过滤进行高压灭菌或消毒。

百合花粉发芽培养基
1.6mM H 3 BO 3
1.0 mM KCl
500μMCaCl 2
15％（w/v）蔗糖
水稻花粉发芽培养基
40mg/L H 3/3> 3
3mM Ca（NO 3 3）2·4H 2 O
3mg/L VB 1
10％（w/v）PEG4000
250 mM蔗糖
均质缓冲液
250 mM蔗糖注意：对于百合花粉，请使用15％（w/v）蔗糖。
50 mM MOPS，pH 7.8
1 mM EDTA
1 mM DTT
1 mM PMSF
1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒
注意：对于百合花粉，加入5mM抗坏血酸，0.6％（w/v）PVPP，1％（m/v）PMSF。
血浆膜分离缓冲液
250 mM蔗糖 5mM磷酸钾，pH7.8。
1 mM DTT
1 mM PMSF
水性聚合物两相体系
6.5％（w/w）PEG3350
6.5％（w/w）葡聚糖T-500
250 mM蔗糖 5 mM KCl
5mM磷酸钾，pH7.8。
1 mM DTT
注意：对于百合，使用6.3％（w/w）PEG3350和6.3％（w/w）葡聚糖T-500。
稀释缓冲液
250 mM蔗糖 50mM MOPS/KOH，pH 7.8
1 mM DTT
1 mM PMSF
洗涤缓冲液
100mM碳酸钠，pH 11.5

致谢

这个协议由Han等人（2010）和Yang和Wang（2017）进行了修改。这项工作得到了中国科技部（授权号：2013CB945101）和中国博士后科学基金（授权号：2016M591284）的支持。

参考

Alexandersson，E.，Gustavsson，N.，Bernfur，K.，Karlsson，A.，Kjellbom，P.和Larsson，C。（2008）。植物血浆膜的纯化和蛋白质组学分析。方法Mol Biol 432：161-173。
Alexandersson，E.，Gustavsson，N.，Bernfur，K.，Kjellbom，P.和Larsson，C.（2007）。 Plasma membrane proteomics。 In：Šamaj，J。和Thelen，JJ（Eds）。植物蛋白质组学。柏林海德堡柏林斯伯格，pp：186-206。
Dai，S.，Chen，T.，Chong，K.，Xue，Y.，Liu，S.and Wang，T（2007）。与花粉萌发和管生长相关的差异表达蛋白质的蛋白质组学鉴定揭示了发芽的水稻花粉的特征。/a>分子细胞蛋白质组学 6（2）：207-230。
Fujiki，Y.，Hubbard，AL，Fowler，S。和Lazarow，PB（1982）。通过碳酸钠处理分离细胞内膜：应用于内质网。 J细胞生物素93（1）：97-102。 />
Hamilton，ES，Jensen，GS，Maksaev，G.，Katims，A.，Sherp，AM和Haswell，ES（2015）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi 。机械敏感通道MSL8调节花粉水合和发芽过程中的渗透力。 350（6259）：438-441。
Han，B.，Chen，S.，Dai，S.，Yang，N。和Wang，T。（2010）。用于相对和绝对定量的比较蛋白质组学的等压标签揭示了百合花粉花粉粒和花粉管的质膜相关蛋白质组的特征， em> .J Integr Plant Biol 52（12）：1043-1058。
Prado，A.M.，Porterfield，D.M.and Feijo，J.A。（2004）。一氧化氮涉及花粉管的生长调节和重新取向。开发 131（11）：2707-2714。
Ren，DT，Han，SC，Yan，LF和Yen，LF（1998）。花粉发芽期间的肌动蛋白和肌球蛋白。 Chin Sci Bull 43：690-694。
Sandelius，AS，Penel，C.，Auderset，G.，Brightman，A.，Millard，M。和Morre，DJ（1986）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： .ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16664771"target ="_ blank">通过自由流动电泳从大豆下胚轴的相同匀浆中分离高纯度的质膜和质膜的部分。 Physiol 81（1）：177-185。
Schindler，J.and Nothwang，H.G。（2006）。水性聚合物两相系统：用于质膜蛋白质组学的有效工具。蛋白质组学 6（20）：5409-5417。
Wang，T.，Liang，L.，Xue，Y.，Jia，PF，Chen，W.，Zhang，MX，Wang，YC，Li，HJ and Yang，WC（2016）。 A受体杂合物介导植物中女性引诱剂的男性感知。 >自然 531（7593）：241-244。

Yang，N.和Wang，T.（2017）。比较蛋白质组学分析显示动态花粉质膜蛋白图谱和受体样激酶和转运蛋白的膜景观对于花粉管生长和水稻雌蕊相互作用是重要的。 BMC植物生物学 17 （1）：2.