材料和试剂

15ml离心管（VWR，目录号：21008-216）
1.7ml微量离心管（VWR，目录号：87003-294）
0.45μm膜过滤器，25mm（EMD Millipore，目录号：HAWP02500）
50ml离心管（VWR，目录号：21008-242）
带过滤器的移液器吸头，100-1,000μl（VWR，目录号：89003-060）
移液器吸头带过滤器，1-200μl（VWR，目录号：89003-056）
移液器吸头带过滤器，1-40μl（VWR，目录号：89003-048）
100 x 15毫米培养皿（VWR，目录号：25384-088）
0.2毫升PCR条形管（VWR，目录号：20170-004）
1 mm路径长度比色皿（VWR，目录号：97000-586）
收件人表皮葡萄球菌RP62a（Christensen等人，1985），携带CRISPR-Cas系统（见注1）（ATCC，目录号：35984）
捐助者具有缀合质粒pG0400（Morton等人，1995）（见附注2）的ATCC420（Kreiswirth等人，1983）（ATCC， BEI资源，目录号：NR-45913）
负面控制表皮炎 LAM104（Marraffini和Sontheimer，2008），缺少CRISPR重复间隔阵列（见注3）
莫匹罗星（美国药典，目录号：1448901）
脑心脏输液汤（BD，BBL，目录号：211060）
脑心浸液琼脂（BD，Difco，目录号：241830）
胰蛋白酶大豆肉汤（BD，Bacto ^TM，目录号：211822）
硫酸新霉素（AMRESCO，目录号：0558-25G）
脑心脏输液汤（见食谱）
脑心浸液琼脂（见食谱）
胰蛋白酶大豆肉汤（见食谱）

设备

微型移液器组（Eppendorf，型号：Research ^® Plus）
37℃培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Heratherm ^{TM高级微生物培养箱）}}
37℃孵育的振荡器能够以160rpm（Eppendorf，型号：I26）
高压灭菌器（Getinge）
分光光度计（GE Healthcare，型号：UltroSpec 10）
微量离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Heraeus ^TM Pico ^TM 17）
数字涡街搅拌机（VWR，型号：Advanced Heavy-Duty Vortex Mixer）
接线线圈
镊子
磁力搅拌板

程序

第一天准备品种

使用含有15μg/ml新霉素的脑 - 心脏输注（BHI）琼脂平板条纹。表皮炎 RP62a（从这里称为"受体"）从-80°C冷冻库存中获得单个菌落。在37°C孵育过夜。
注意：以相同的方式，染色阴性对照菌株，表皮葡萄球菌LAM104。
接种S。金黄色葡萄球菌将pG0400（这里称为"供体"）从冷冻库中加入到含有5μg/ml莫匹罗星的2ml胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中。在37℃下摇荡过夜过夜。
注意：虽然表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌菌株都可以在BHI或TSB中繁殖，但是在本方案中针对每个菌株表达的培养基与原始方案中使用的生长培养基一致，证明了抗质粒免疫表皮葡萄球菌RP62a中的III-A型CRISPR-Cas系统（Marraffini和Sontheimer，2008）。

第二天生长的殖民地和过滤器交配

在孵育至少16小时后，应该看到大的（> 1毫米直径）个体受体菌落。将3个单独菌落的全部接种到含有2μgBHI的15ml离心管中，其中含有15μg/ml新霉素。
注意：

此外，将实验中包含的任何对照一式三份接种。
同时，在15 ml离心管中加入50μl的过夜供体培养物至5ml TSP与5μg/ml莫匹罗星。

在37°C振荡下，供体和受体均可生长。
注意：同时，将每3个生长的受体培养物中的一个BHI板置于30℃的孵育器中以预热（参见注4）。
约6小时后，检查受体和供体菌株的OD <600>

将900μlBHI肉汤加入分光光度计比色杯中。加入100μl培养物种之一的受体培养物。混合好。
在用BHI消隐后，测量和记录培养物的1:10稀释度的OD 600。
用剩余的受体培养物重复步骤2c i和2c ii。
对供体培养物重复步骤2c i和2c ii，用TSB代替BHI
在进行之前，所有培养稀释液的OD 600必须大于0.20。如果OD 600还不够高，则返回振荡器，并在再次检查OD 600之前生长一段时间。

计算供体和受体结合以达到1：4比例（受体：供体）用于过滤器交配的量，如表1中的示例所示。
注意：对于每个培养物，将200除以步骤2c中所测量的OD 600。在1 000的OD 600下，有约8×10 8 cfu/ml的供体和2×10 8个/cfc/ml的供体收件人。该计算允许标准数量的供体（大约1.6×10 9个/cfu）和接受者（约4×10 8个/cfu）组合在所有被测试的样品中。

表1.确定用于过滤器交配的组合c 的体积的样本计算

文化	OD ₆₀₀ （1:10稀释）	200/OD ₆₀₀ （要添加的体积，μl）
RP62a（1）	0.42	476
RP62a（2）	0.42	476
RP62a（3）	0.41	488
LAM104（1）	0.44	455
LAM104（2）	0.39	513
LAM104（3）	0.44	455
RN4220/pG0400	0.56	357

将1.7ml微量离心管中的第一，未稀释的受体培养物的计算体积与未稀释的供体的计算体积相结合。
注意：重复上述步骤，直到所有供体 - 受体对组合成分离的微量离心管。
洗涤合并的培养物以通过将离心管以6,200×g离心在台式离心机中离心2分钟来除去抗生素。取出上清液，将颗粒重悬于1 ml BHI中，无抗生素。重复离心。
使用无菌镊子，将一个0.45μm的膜过滤器放置在不含抗生素的BHI板上，每个供体 - 受体对上，在单个板上放置多达3个过滤器（图1）。

Fi gure 1。用于过滤器配合的样品板，显示具有三个膜过滤器的板 在每个过滤器中心的过夜生长中覆盖
从含有供体和受体组合的每个微量离心管中取出悬浮液。将沉淀重悬于100μlBHI肉汤中，并小心地将其移至膜过滤器的中心，小心不要让任何悬浮液从膜中脱落，如图1所示。保持所有细菌悬浮液至关重要在过滤器上，因为该测定是定量的，并且需要所有细胞的完全恢复。
每个微量离心管重复此操作，将每种培养物的重悬浮物置于其自身的过滤器上
盖上板子，放在台面上，直到细胞悬浮液完全干燥
在30℃的培养箱中将板倒置倒置过夜。

第3天。连续稀释和电镀接收者和转接合子

将含有新霉素（15μg/ml）的一个BHI琼脂平板和含有来自前一夜的每个过滤器的新霉素（15μg/ml）和莫匹罗星（5μg/ml）的一个BHI琼脂平板。
在50ml离心管（每个过滤器一个）中，加入3ml不含抗生素的BHI肉汤。
使用无菌镊子，将每个过滤器从板上取下，并将其放入步骤3b中制备的50ml管中
旋转每个管，直到过滤器上的细胞完全重新悬浮，并且在过滤器上不可见生长
连续稀释细胞悬浮液

在一条PCR管中的每个8个管中，加入90μlBHI肉汤。
从步骤3d中取出10μl细菌悬浮液，并将其加入第一个PCR条形管中，重复上下移液重悬（这是10次/sup的稀释）。
使用新的移液管吸头，从10μL/sup稀释液中取出10μl，并将其加入第二个PCR管中，反复进行上下移液以重悬浮（这是10次/sup>稀释）
重复步骤3e iii以创建稀释液至10 ^-8。
注意：可以使用进行一系列10倍连续稀释的替代方法，例如在96孔板中使用多通道移液管。

将每个稀释液10μl点样到含有新霉素的预热BHI板上，另一个含有新霉素和莫匹罗星（参见附注5）。要接受接受者菌落计数的所有稀释液应铺板在同一块板上，如图2A所示，所有要进行转结合菌落计数的稀释液应镀在额外的板上，如图2B所示。
注意：以45°的角度倾斜板，直到稀释液的下降几乎到达板的边缘，然后将其平放在台面上并让其干燥。

图2.来自使用RP62a菌株的缀合测定的样品平板，显示接受者（A. 1.5×10 9 cfu/ml）和转导结合物（B.0cfu/ml）强>
对每个过滤器重复步骤3e和3f。
让台板在台面上覆盖时干燥，然后在37℃下孵育过夜。

第4天。接收者和转运结合计数
1. 从第2天计算每个过滤器的收件人数（仅含有新霉素的平板上的菌落数），如图2A所示。
2. 计数第2天每个过滤器的转导结合物（含有新霉素和莫匹罗星的平板上的菌落数），如步骤4a所示，并显示在图2B中。
3. 计算共轭效率（见数据分析）

数据分析

共轭效率的计算

共轭效率是每个初始受体细胞产生的转导结合物的数量的量度。它可以简单地计算如下，示例如表2所示：

表2.计算 共轭度 n 样本共轭测定的效率

St rain	Transconj ugants （cfu/ml）	收件人 s （cfu/ml）	共轭 Ef ficiency
RP62a（1）	1 x 10 ³	7 x 10 ⁹	1 x 10 ^-7
RP62a（2）	2 x 10 ²	1 x 10 ⁹	2 x 10 ^-7
RP62a（3）	0	4 x 10 ⁹	0
LAM104（1）	1.3 x 10 ⁵	3 x 10 ⁹	4 x 10 ^-5
LAM104（2）	9 x 10 ⁴	3 x 10 ⁹	3 x 10 ^-5
LAM104（3）	9 x 10 ⁴	4 x 10 ⁹	2 x 10 ^-5

高效率表示无效的CRISPR系统，而降低的效率表示活动的CRISPR防御。

与没有CRISPR系统的应变相比，CRISPR系统存在时通常可以看到缀合效率降低100至1,000倍。

数据呈现
数据通常以条形图显示，以对数标度显示cfu/ml（菌落形成单位/毫升）中的接受者和转录结合体的数目，并伴随图3计算的共轭效率，如图3所示。 >

Fi gure 3。来自使用S的共轭测定的数据的样本图。表皮细胞 RP62a和LAM104作为收件人 。错误栏表示一式三份测量的标准差。

笔记

本试验中可以使用其他菌株作为受体菌株。 S上。表皮细胞RP62a自然携带CRISPR间隔区，其靶向在共轭葡萄球菌质粒如pG0400（Marraffini和Sontheimer，2008）上发现的 基因。其他含CRISPR的原核生物可以被使用，如果它们适合接受共轭质粒。接受者选择中的另一个重要考虑是确保接受者具有将其与供体菌株区分开的选择标记。在与S共轭测定的情况下。表皮细胞， S 。表皮葡萄球菌RP62a对新霉素具有抗性，因此这种抗性可用于仅在第3天仅选择转导结合体而不是选择供体菌株本身。天然不具有不同抗生素敏感性的受体菌株可以用含有附加电阻标记（例如pC194 [Ehrlich，1977] for /em>的）。选择任何质粒，确保其来源与缀合质粒相容，以允许在转导结合体中维持和选择两种质粒。如果使用不同的选择性标记，请更换适合培养和电镀的抗生素
其他菌株您可以用作该测定中的供体菌株，以及额外的共轭质粒也可以使用。供体菌株需要能够与受体菌株进行缀合，并且RN4220对于这种共轭测定是非常方便的，因为它可以与进行共轭。 pidermidis RP62a，并且缺少CRISPR系统，允许即时摄取和维持质粒，例如可能在携带CRISPR的菌株中降解的pG0400质粒。也可以使用另外的共轭质粒，这取决于受体菌株内发现的CRISPR间隔区。如果测试CRISPR在受体菌株中是否具有抗质粒活性的功能，则必须使用与接受者的CRISPR阵列内发现的间隔物相互补充的原始质粒的共轭质粒。在RP62a的情况下，pG0400自然具有该原始样品，但是在许多系统中，可能需要用原始样品技术设计共轭质粒。如果使用不同的共轭质粒，请适当选择抗生素进行培养和铺板。另外，如果工程化共轭质粒，请务必按照要测试的特定系统中CRISPR靶向所需的规则，例如遵循I类和II类系统的PAM要求（Mojica e ，，以及允许Type III-A系统干扰的所需不匹配（Marraffini和Sontheimer，2010） >
LAM104是RP62a的工程衍生产品，缺乏重复间隔阵列，可防止CRISPR-Cas发挥作用（Marraffini和Sontheimer，2008）。如果使用RP62a以外的应变，建议使用CRISPR-Cas不起作用的阴性对照。合适的阴性对照包括1）使用缺乏CRISPR-Cas的关键组分的受体菌株，或2）使用携带缺乏合适原始分离物的共轭质粒的供体菌株。 S上。表皮炎 LAM104无法在商业上可用，但可根据要求由Hatoum-Aslan实验室提供。
用 S。表皮葡萄球菌RP62a，如果在37℃下进行过滤器交配，则在第4天观察到受试者的背景计数增加。为了获得更清洁的效果，常规使用30°C的孵育，尽管可以对其进行修改以适应任何生物体的生长要求。
用 S。作为收件人的菌株，transconjugants通常以10个浓度的浓度观察到，其中10μg/⁰ -10 ⁵ cfu/ml，因此通常仅将10℃至10℃-3小时稀释在含有新霉素和莫匹罗星的BHI平板上获得菌落数。接受者通常为约10 cfu/ml，因此通常将仅有10℃-5℃至10℃-8小时的稀释液涂覆在含有新霉素获得菌落数。

食谱

脑心输液汤

将19.5 g脑心脏输注溶解于500 ml去离子水（DI）水中

在121°C高压灭菌30分钟，并在室温下储存

脑 - 心输液琼脂

将29克脑心脏输注琼脂溶解于500毫升去离子水中

在121℃高压灭菌30分钟，然后在磁力搅拌板上搅拌，直至冷却至足以舒适，然后立即加入抗生素并倒入盘中（每500毫升20片）
注意：介质也可以在室温下储存，然后在微波炉中加热，液化并倒入。

胰蛋白酶大豆肉汤

将15g胰蛋白酶大豆肉汤溶于500ml去离子水中

在121℃高压灭菌30分钟，并在室温下储存

致谢

A.-H-A。由阿拉巴马大学（UA）艺术与科学学院支持; UA学院研究，奖学金和创意活动研究所（CARSCA）的资助;和国立卫生研究院[5K22AI113106-02]。该协议改编自Marraffini和Sontheimer（2008）发表。

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