材料和试剂

15ml离心管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352096）}
50ml离心管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352070）}
T25烧瓶培养（Nest Biotechnology，目录号：707003）
24孔板（Nest Biotechnology，目录号：702001）
十号刀片手术刀（Aspen Surgical，目录号：371610）
细胞过滤筛（Corning，Falcon ^{®，目录号：352340）}
培养皿培养（Nest Biotechnology，目录号：704001）
嗅粘膜新鲜标本（人）
Hanks的平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：24020117）}
抗生素 - 抗真菌药（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15240062）}
Dispase II（Sigma-Aldrich，目录号：D4693）
胶原酶IA（Sigma-Aldrich，目录号：C9891）
Dulbecco改良的Eagle培养基/F12（DMEM/F12）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：31331028）}
神经生长因子（NGF）（Sigma-Aldrich，目录号：N0513）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200056）}
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10270106）}
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
牛血清白蛋白（BSA，粉末）（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
兔抗S100-β的一级抗体（Sigma-Aldrich，目录号：S2644）
FITC缀合的山羊抗兔（Abcam，目录号：ab6717）
（可选）阿糖胞苷或阿糖胞苷（Sigma-Aldrich，目录号：C3350000）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：18912014）}
多聚甲醛（粉末）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
培养基（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
4％多聚甲醛（见食谱）
0.2％Triton X-100（见配方）
10％牛血清白蛋白（BSA）（见食谱）

设备

小镊子手术工具（精细科学工具，目录号：11050-10）
血细胞计数器（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629）
倒置荧光显微镜（Optika，型号：XDS-2FL）
离心机（Hettich Lab Technology，型号：Universal 320 R）
通风罩（Vision Scientific，型号：VS-7120LV）
CO 2细胞培养箱（Memmert，型号：INC108 T2T3）
37°C水浴（Memmert，型号：WNB 14）

程序

收集嗅粘膜组织
1. 在全身麻醉下从患者的上鼻甲组织内窥镜获得新鲜样品（直径4mm）。
2. 本研究由德黑兰医科大学伦理委员会批准。
3. 手术前，患者签署书面同意书。
4. 本研究中没有提供新鲜样本的年龄限制。
5. 在与耳鼻喉科（ENT）外科医生协调后，将嗅粘膜组织置于含有10％抗生素（抗生素 - 抗真菌剂）的5ml冷HBSS的15ml管中。
6. 嗅粘膜组织在干冰上输送到实验室。
从嗅粘膜分离OEC
1. 每次用5ml冷PBS洗涤嗅粘膜组织3次。
2. 将嗅黏膜组织浸泡在1ml Dispase II溶液（2.4IU/ml）中，在37℃孵育1小时。
3. 在倒置光学显微镜下使用微型刮刀从嗅觉上皮解剖固有层。固有层是厚橙色层，上皮是薄的半透明灰色层。
4. 将固有层切成小块。
5. 将片转移到含有1ml胶原酶IA的新的15ml Falcon管中，并在37℃下孵育20分钟。
6. 通过向管中加入9ml PBS来灭活胶原酶IA
7. 将悬浮液以250 x g离心5分钟。
8. 将所得沉淀重悬于1ml补充神经元生长因子（NGF，50ng/ml），1％（100U/ml）抗生素 - 抗真菌剂的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12培养基中。
9. 将含有微小组织的悬浮液转移到两个含有补充有神经元生长因子（NGF，50ng/ml），1％（100U/ml）抗生素的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）/F12培养基的T25烧瓶中，各种抗真菌药物
10. 在37℃，5％CO 2和95％湿度的培养箱中孵育3-4周。
11. 每3天更换培养基。
  注意：经过14天的人类嗅鞘固有培养后，OECs从球形簇的周围释放出来。大多数细胞的形态是纺锤形和双极的，具有长的过程和小的细胞质或具有短过程和丰富的细胞质如星状形态的多极形式。请注意，固有层固有培养物中可能存在成纤维细胞污染。 Fibrolast形态也是纺锤形和双极的长过程。（图1和图2）
12. 3-4周后，OEC准备进行亚文化。
  
  图1. OEC与人类嗅粘膜分离的不同阶段。 A.鼻子外观;嗅黏膜上鼻甲的位置; C.来自上鼻甲的人类嗅粘膜活检;唾液Ⅱ消化后嗅黏膜的固有层E.胶原酶IA消化后培养的固有层。 F.从固有固有层周围释放的嗅鞘细胞，比例尺=100μm。
  
  图2.第一次通过后的OEC。 比例尺= 100μm。
嗅黏膜固有层原发性OEC的亚文化
1. 检查OECs在倒置显微镜下的汇合。细胞密度达到80％时，培养细胞，播种3-4周
2. 使用5ml无菌移液管在生物罩下从每个T25烧瓶中取出培养基
3. 用3ml温热（37℃）PBS洗涤细胞，然后除去PBS。
4. 在37℃的培养箱中用1ml温（37℃）0.05％胰蛋白酶-EDTA将细胞胰蛋白酶处理1分钟。
5. 通过向每个T25烧瓶中加入含有10％FBS和1％抗生素抗真菌剂的4ml DMEM/F12，然后将细胞悬浮液从每个烧瓶转移到15ml Falcon管中停止胰蛋白酶-EDTA反应。
6. 将细胞悬浮液在室温下以250×g离心5分钟
7. 用5ml无菌移液管从每个管中取出培养基。
8. 在每个管中用1ml含有DMEM/F12,10％FBS和1％抗生素 - 抗霉菌剂的新鲜培养基重悬。
9. 重新悬浮和计数后，将细胞种植在24孔培养皿（每孔5×10 3个细胞密度）中，进行免疫细胞化学（转到步骤D2）和T25烧瓶（5 x 10 细胞在培养瓶中）
10. 在含有10％FBS和1％（100U/ml）抗生素抗真菌剂的DMEM/F12培养基中，在37℃，5％CO 2和95℃的培养箱中培养含有OEC的T25培养瓶湿度为4-5天。（图2）
免疫组化
1. 将种子5×10 3个细胞注入24孔培养皿的每个孔中
2. 在室温下24小时后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）将每孔洗涤三次
3. 用PBS中的4％多聚甲醛固定细胞20分钟
4. 在PBS中，室温洗涤细胞三次，每次5分钟
5. 用0.2％Triton X-100渗透细胞膜15分钟
6. 在PBS中，室温洗涤细胞三次，每次5分钟
7. 用10％牛血清白蛋白封闭细胞1 h
8. 在PBS中的1％BSA中稀释兔抗S100-β1：100的一抗。
9. 在PBS中，室温洗涤细胞三次，每次5分钟
10. 稀释FITC-缀合的山羊抗兔1：500的二抗在PBS中的1％BSA中
11. 在室温下在黑暗中孵育细胞与FITC-缀合的山羊抗兔二抗2小时。
12. 在PBS中，室温洗涤细胞三次，每次5分钟
13. 通过倒置荧光显微镜观察图像细胞（图3）
  
  图3.纯化的原代嗅鞘细胞培养物。 OECs表达S100-β的抗原。比例尺=50μm。

数据分析

通过荧光免疫细胞化学分析检测S100-β抗原，确定培养的原代OECs。该分析表明细胞表达S100-β抗原。测试结果从三个独立实验中获得。

笔记

大部分步骤应在无菌通风罩内进行。
所有试剂应在37℃预热，然后再使用。异常是用冷PBS洗嗅粘膜组织。
如果在原代培养中观察到成纤维细胞污染，则应在接下来的10天内在细胞培养基中加入胞嘧啶阿拉伯糖苷至终浓度为5μg/ml。胞嘧啶阿糖胞苷是成纤维细胞的生长抑制剂

食谱

培养基（200ml，10％FBS，1％抗生素 - 抗真菌剂） 178 ml DMEM/F12
20毫升FBS
2 ml抗生素 - 抗真菌药物储存于4°C
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（500 ml）
1 PBS片剂溶于500 ml MiliQ水中过滤并储存在4°C
4％多聚甲醛
4g多聚甲醛溶于100ml PBS中
0.2％Triton X-100
10μlTriton X-100溶于5ml PBS中
10％牛血清白蛋白将0.5 g牛血清白蛋白溶解在5ml PBS中

致谢

本研究得到了获得于医学先进技术学院的授权号20035，并授予德黑兰医科大学脑脊髓损伤研究中心19925年。该协议改编自Hashemi等人。（2016）。

参考

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Hashemi，M.，Fallah，A.，Aghayan，HR，Arjmand，B.，Yazdani，N.，Verdi，J.，Ghodsi，SM，Miri，SM and Hadjighassem，MR（2016）。多形态成胶质细胞瘤基因治疗的新方法：人类嗅鞘细胞作为新载体用于自杀基因递送。 < Mol Neurobiol 53（8）：5118-5128。
Huang，ZH，Wang，Y.，Cao，L.，Su，ZD，Zhu，YL，Chen，YZ，Yuan，XB和He，C。（2008）。通过单细胞迁移测定培养的嗅鞘细胞的迁移性质细胞Res 18（4）：479-490。
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