材料和试剂

MF-Millipore过滤器（EMD Millipre，目录号：SCGPU05RE）
Eppendorf管（Eppendorf，目录号：022363204）
细胞培养瓶（Corning，目录号：3275）
细胞培养板（12孔培养皿接种板，无菌）（EMD Millipre，目录号：PIMWS1250）
移液器尖端
15 ml培养管
电池刮板（Corning，目录号：3010）
ZapCap瓶盖过滤器，孔径0.2μm（Maine Manufacturing，目录号：10443421）
血清学移液器（1，5，10，25，50 ml）（康宁，目录号：4010,4050,4100,4250,4501）
培养管（Sigma-Aldrich，目录号：T1661）
单核细胞增多性李斯特菌菌株F2365（野生型菌株）和F2365Δ2117（突变菌株）（Reddy等人，2016）
Caco-2细胞系（ATCC，目录号：HTB-37）
70％乙醇（Fisher Scientific，目录号：BP82014）
胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T3924）
脑心脏输注（BHI）琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：70138）
BHI肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：53286）
庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1397）
鹰的最低必需培养基（EMEM）（ATCC，目录号：30-2003）
胎牛血清，认证，热灭活（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10082147）}
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：234729）
注意：本产品已停产。
磷酸盐缓冲盐水，10倍（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P5493）
cEMEM（见配方）
0.1％Triton-X 100（参见食谱）
1x PBS（见食谱）

设备

水浴，37°C（Thermo Fisher Scientific）
CO 2/2强制空气培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Forma ^TM Steri-Cult ^{CO ₂孵化器，目录号：3307TS）}}
生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：1300系列II类）}
倒置显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse Ti-S）
移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：4642070）
Pipettor（Daigger Scientific，型号：便携式移液器XP移液器控制器）
血细胞计数仪（Fisher Scientific，目录号：S17040）
37℃培养箱（Thermo Fisher Scientific）
37℃振荡器（Thermo Fisher Scientific）
微量离心机，4°C（Eppendorf）
费雪科学声波分解器（Fisher Scientific，型号：100）
涡旋（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：LP Vortex Mixer，目录号：88880018）}

程序

生长和维持Caco-2细胞系
1. 使用MF-Millipore过滤器制备培养基，将Caco-2，人结肠腺癌细胞维持在cEMEM中（完整的EMEM，参见食谱）
2. 播种细胞：
  1. 通过在37℃水浴中温和搅拌，从ATCC（或实验室中先前冷冻的细胞）中解冻一瓶冷冻的Caco-2细胞。为了减少污染的可能性，请将O型圈和管帽盖保持在水中。解冻应快速（约2分钟）
  2. 一旦内容物解冻，就从水浴中取出小瓶，并通过浸入或喷洒70％乙醇来净化。从这一点开始的所有操作都应该在严格的无菌条件下进行
  3. 将小瓶内容物转移到含有9.0ml cEMEM的离心管中，并以125×g旋转5至7分钟。丢弃上清液。将细胞重悬于1ml cEMEM中，并将细胞悬浮液转移到含预热（37℃）cEMEM的烧瓶中。将烧瓶置于CO 2/2强制空气培养箱中，37℃
  4. 接种后24小时，检查显微镜下的细胞附着，如果连接到烧瓶表面，缓慢吸出培养基以除去死细胞并加入预热（37℃）的cEMEM。
3. 每48-72小时或当媒体的颜色发生变化时重新进入细胞。为了重新喂养细胞，用吸管小心吸出现有培养基，并将新鲜培养基添加到烧瓶中，而不会干扰细胞。
4. 每48小时检查一次细胞的污染和汇合。当烧瓶表面的80％被细胞覆盖时，它们可以进行传代（Natoli等人，2012）。在将它们用于实验之前，需要传递至少3个周期的细胞。当烧瓶被污染时，介质浑浊，细胞不粘附到烧瓶表面
5. 对于传代，移除介质并用1x PBS洗涤单层。加入胰蛋白酶-EDTA溶液2-4ml（取决于烧瓶的大小），并在37℃孵育1-4分钟（不要过孵育细胞）。当细胞开始呕吐时，添加培养基（1:10，胰蛋白酶至培养基比例）以灭活胰蛋白酶并彻底移液数次以获得均匀的细胞悬浮液。
6. 使用血细胞计数器计数细胞并种子密度为10 5个细胞/孔的12孔细胞培养板。每个电池将需要1到2毫升的尺寸和制造商。相应地计算单元格。
细菌培养物的制备
1. 使用无菌微生物学技术的条纹李斯特菌菌株（WT和Mutant）从BHI琼脂上的冷冻培养物中，并将它们置于37℃的培养箱中48小时。
2. 从新鲜生长的细菌培养板中，用移液管尖端挑取单个分离的菌落，并将其放入含有10ml BHI肉汤的15ml培养管中。将试管在37℃振荡器中孵育过夜。（见注5）
3. F2365（野生型）和F2365Δ2117（突变体）L的夜间培养物（15ml）。如果需要，在BHI肉汤中的单核细胞增生李斯特氏菌菌株在感染当天使用新鲜BHI肉汤调整至OD 600> 1.0。
4. 对于每个菌株，将100μl上述细菌悬浮液在台式微型离心机中以3,000xg 沉淀2分钟。
5. 洗涤沉淀，并将其重悬于1ml新鲜温热（37℃）cEMEM中。
6. 使用步骤B3使用30μl感染Caco-2细胞。
粘附分析
1. 使用来自步骤B3的细菌培养物（感染的多重性[MOI]：1Caco-2细胞：10个细菌细胞），按照图1所示的模板感染来自步骤A5的具有Caco-2细胞的平板。
  
  图1.用于感染Caco-2细胞的板模板。将Caco-2细胞接种在12孔细胞培养板中，并用模板中标记的合适的细菌菌株感染。对于每个菌株，以平板每3次重复进行感染。三口井未感染或未经处理，三口井感染无细胞生长激素免疫细胞，作为阴性对照（NC1和NC2）。
2. 一次感染一口，每次感染后更换移液管。（见注4）
3. 将板短暂离心45秒，并在37℃孵育30分钟。离心有助于细菌与哺乳动物细胞的混合和结合
4. 孵育后，用1x PBS洗涤细胞5次，用500μl冷的0.1％Triton X-100溶解
5. 使用1xPBS将所得悬浮液稀释（1/100,1/1,000和1/10,000）。
6. 将100μl1/1,000和1/10,000稀释的悬浮液铺在BHI琼脂上，并在37℃下培养48小时。（见注5）
7. 孵化后48小时计数细菌菌落，记录并计算菌落形成单位
入侵检测
1. 来自步骤A5的具有Caco-2细胞的板用来自步骤B3（MOI：1Caco-2细胞：10个细菌细胞）的细菌培养物感染，如图1所示。
2. 一次感染一口，每次感染后更换移液管。（见注4）
3. 将板短暂离心45秒，并在37℃孵育2小时
4. 孵育后用1x PBS洗涤两次，加入含有庆大霉素（100μg/ml）的新鲜培养基，以杀死细胞外细菌。
5. 在感染后2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22和24小时，用1x PBS洗涤细胞两次，并使用500μl冷的0.1％Triton X-100 。一旦裂解的细胞漂浮在溶液中，使用移液管小心地混合溶液（无飞溅）去除附着细胞（如果有的话）。移液也有助于破坏哺乳动物细胞。
6. 从每个孔转移裂解物，分离适当标记的微量离心管，并进行超声处理
7. 声波除垢器设置：设置3（操作频率：20 kHz和额定功率：120瓦），3个脉冲，5秒每个有助于进一步裂解Caco-2细胞，但不会伤害L。单核细胞增生素
8. 将100μl1/1,000和1/10,000稀释的悬浮液铺在BHI琼脂上，并在37℃下培养48小时。（见注5）
9. 孵化后48小时计数细菌菌落，记录并计算菌落形成单位

数据分析

注意：可以使用Microsoft Excel执行学生的t检验来分析数据。

根据电镀过程中的稀释度计算菌落形成单位
对于Student's t 测试，使用excel来计算P 值（alpha），以调查Caco-2细胞感染后的粘附和细胞内细菌数量的显着差异。使用0.05的α水平来确定统计学显着性
使用Microsoft Excel来计算标准错误（用于错误栏）。
使用Microsoft Excel绘制粘附分析的条形图（图2）和入侵测定的点散点图（图3）。

图2. F2365和F2365Δ2117附着于Caco-2细胞。每个条代表六次重复的平均值;标准误差由误差线指示。 *与其他治疗有显着差异。使用0.05水平的α水平来确定统计学显着性

图3. F2365和F2365Δ2117侵袭Caco-2细胞系。每个点代表六次重复的平均值;标准误差由误差线指示。 F2365和F2365Δ2117之间的统计学显着性差异由*表示。使用0.05水平的α水平来确定统计学显着性

笔记

记录BHI琼脂上的稀释液，以便稍后使用，从细菌计数计算细菌菌落形成单位的实际数量。
执行所有感染一式三份，并对每个菌株执行2次独立测定。
包括如图1所示和描述的阴性对照。这些阴性对照不应在BHI平板上产生菌落。如果在阴性对照中观察到菌落，那么就有潜在的污染，需要重复实验
对于每个时间点使用一个板。每个时间点使用两个平板，以获取六个重复的数据。
所有步骤都是无菌或无菌条件下进行的，因此在板上只能观察到一种类型的菌落（常规圆形细菌菌落）或没有菌落。利斯特里克菌落是单个或短链发生的常规白色圆形菌落。如果有多个有色或非相同的菌落，那么就会有污染。

食谱

cEMEM（过滤灭菌）
400 ml EMEM
100毫升FBS
5毫升笔/步骤
0.1％Triton-X 100（过滤灭菌）
99.9毫升Milli-Q水
100μl100％Triton-X 100
3. 1x PBS（过滤灭菌）
90 ml Milli-Q水
10ml 10倍PBS

致谢

该协议是从以前发表的研究（Reddy等人，2016）改编的。该项目由USDA ARS协议＃58-6402-2729资助，该协议由USDA CRIS项目MIS501170"密西西比州食品安全和收获后技术中心"运营。

参考

Angelis，ID和Turco L.（2011）。 Caco-2细胞作为肠道吸收的模型。 Curr Protoc Toxicol 第20章。
Jaradat，ZW和Bhunia，AK（2003）。粘合力，Caco-2细胞和小鼠模型中单核细胞增生利斯特氏菌血清型的入侵和易位特征。应用环境微生物69（6）：3640-3645。 br />
Lecuit，M。（2005）。了解如何>单核细胞增生利斯特氏菌靶向并穿过主体障碍。 Clin Microbiol Infect 11（6）：430-436。
Natoli，M.，Leoni，BD，D'Agnano，I.，Zucco，F.and Felsani，A。（2012）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi .nlm.nih.gov/pubmed/22465559"target ="_ blank">良好的Caco-2细胞培养实践 体外毒素 26（8）：1243-1246。 />
Reddy，S.，Akgul，A.，Karsi，A.，Abdelhamed，H.，Wills，RW和Lawrence，ML（2016）。单核细胞增生利斯特氏菌细胞壁表面锚蛋白LapB在毒力，粘附和细胞内复制中的作用。 Microb Pathog em> 92：19-25。
Reddy，S.and Lawrence，ML（2014）。单核细胞增生利斯特氏菌的毒力表征。方法Mol Biol 1157：157-165。
Sambuy，Y.，De Angelis，I.，Ranaldi，G.，Scarino，ML，Stammati，A.and Zucco，F。（2005）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15868485"target ="_ blank">作为肠屏障模型的Caco-2细胞系：细胞和培养物相关因子对Caco-2细胞功能特征的影响细胞生物毒素21（1）：1-26。