材料和试剂

将15ml Falcon管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：339651）
50ml Falcon管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：339653）
225ml Falcon瓶（Corning，Falcon ^®，目录号：352075）
蛔虫
蛔虫可以从每天处理数千只猪的屠宰场收集，并使用小肠制成香肠肠衣。蛔虫可以从肠内收集的手（用手套）取出，并用机器将其推出。通常需要两个人3-5小时收集〜1000个蠕虫。新鲜的组织和胚胎都可以从这些活蠕虫获得。女性蛔虫也可以从Carolina Biological，Living Zoology Department订购。这些女性在冰上死亡，蛔虫合子可以从近端子宫获得
氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：S318-1）
H 2 O（通过Milli-Q 积分水净化系统纯化）
DAPI（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-3598）
液氮（Airgas，目录号：NI NF160LT22）
苯基甲烷磺酰氟（PMSF）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：36978）}
cOmplete ^{TM蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：0493116001）}
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-3）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：P217-500）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：BP350-500）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：P285-500）
盐酸（HCl）
1M Tris-HCl，pH8.0（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^{TM，目录号：AM9856）}
1M Tris-HCl，pH7.0（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^{TM，目录号：AM9851）}
次氯酸钠溶液（Fisher Scientific，目录号：SS290-1）
氢氧化钾（KOH）（Fisher Scientific，目录号：P250-1）
氯化镁（MgCl 2）（Fisher Scientific，目录号：M33-500）
EGTA（Thermo Fisher Scientific，USB，目录号：15703）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：BP220-212）
DTT（Fisher Scientific，目录号：BP172-5）
精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S3256）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S2626）
Nonidet P-40（NP-40）（Alfa Aesar，Affymetrix/USB，目录号：J19628）
Triton X-100（Promega，目录号：H5142）
甘油（Fisher Scientific，目录号：BP229-1）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250-10ML）
EDTA（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：17892）}
PBS缓冲液（参见食谱）
1M Tris-HCl，pH 7.8（参见食谱）
KOH /漂白剂（0.4N KOH/1.4％次氯酸钠）（参见食谱）
核提取缓冲液A（参见食谱）
核提取缓冲液B（参见食谱）
核提取缓冲液C（参见食谱）
核存储缓冲区（见配方）

设备

锥形瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：4112-0125,41112-0250或4112-0500）}
1L烧杯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：12011000）
4L塑料烧杯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：12014000）
摇动培养箱（例如，Lab-Line，型号：4629）
荧光显微镜（例如，Nikon Instruments，型号：TS100）
冷冻离心机（例如，Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall ^TM Legend ^TM XTR）
金属均质器（WHEATON，目录号：357574）
砂浆和杵（例如，Fisher Scientific，目录号：S02591和S02594）

程序

从蛔虫分离胚胎

蛔虫胚胎解剖
1. 注意，雌虫的前端较薄。从前端向后看，识别脐带，并在生殖器腰带之前或之后切割雌性蠕虫（见图1A）。男性通常小于女性，并且具有强烈弯曲的后方（见图1B）。
2. 轻轻地将子宫完全拉出，同时握住女性的后部，直到感到紧张。检查子宫的长度，在冰上约1L的烧杯中切片并将子宫的近端¼收集到PBS（pH7.0）中。近端区域的长度将变化，因为单个雌性蠕虫的总体尺寸可能非常不同（见图1C）。
  
  图1.蛔虫胚胎解剖。 A.女性蛔虫。浅蓝色箭头表示生殖器腰带;红色箭头是切割区域。（男）蛔虫（左）与女性蛔虫（右），男性蛔虫较小，后部有强烈的曲线箭头）（修改自 https://en.wikipedia.org/wiki/Ascaris_suum ）。 C.女性蜗牛的切割在生殖器腰带与子宫拔出。将子宫的近端¼（白色箭头）收集到PBS中
3. 处理远端3/4的子宫。
4. 用冰冷的PBS，pH7.0（接头冲洗;测量烧杯中的子宫体积）在烧杯中冲洗合并的子宫3次（见图2）。
  
  图2. Rinsed pooled 蛔虫 uteri
5. 用0.5N NaOH处理子宫〜1小时，在室温下轻轻搅拌，以保持材料悬浮子宫/NaOH的比例是约50ml 50ml/10升0.5N NaOH。搅拌以保持所有物料停产。
6. 允许约45分钟的溶液通过重力沉降。
7. 缓慢小心地倾倒溶液（作为安全预防措施，倾倒溶液应在弃置之前进行高压灭菌）。请注意，当您倾倒时，您可以倾吐出来，通常会出现一些白色的浮动物质。鸡蛋留下来，当你看到他们靠近喷口停止滗水时。
8. 重复0.5N NaOH处理并倒出上清液。
9. 将蛋悬浮液转移到225ml Falcon瓶中。在4℃下以1,250×g/g收集胚胎10分钟。
10. 用冰冷的MilliQ水洗涤胚胎3-4次，通过在4℃下以1,250×g旋转10分钟。
11. 用冰冷的PBS（pH2.0）洗涤，并在4℃下以1,250×g收集胚胎10分钟，最后将胚胎重新悬浮并储存在5体积的冰冷PBS（pH2.0）中，。
  储存于4°C（胚胎可以在4°C保存至少3-5年）（见图3）。
  注意：近端子宫的典型胚胎产量为〜20-25毫升/500个蠕虫。
  
  图3.蛔虫胚胎 将蛔虫胚胎放入5体积冰冷的PBS，pH2.0中。在4°C储存。

蛔虫胚胎制备用于细胞核分离的发育阶段胚胎

重悬胚胎并移除适合实验目的的一定体积的悬浮液（参见表2，用于不同类型实验的细胞核数量）。
注意：去除几丁质壳（去除衣壳）和洗涤后，包装的胚胎体积将减少60％。
在室温下将胚胎转移到1,250×g 5分钟，弃去上清液。
用50ml PBS洗涤胚胎，pH 2.0，如上旋转并弃去上清液。
将胚胎重悬于约20体积的PBS，pH为2.0，并将其置于无菌的一次性锥形瓶中，盖上松动以便于通气。
注意：PBS的体积不应超过烧瓶的30％。例如，对于250ml烧瓶，PBS的最大体积应为75ml。

在培养箱中孵育30℃的胚胎，以100rpm摇动所需的发育时间（参见开发时间表1）。

表1.蛔虫在30℃下振荡时的胚胎时间

开发时间	主要阶段	其他注释
0 h	1个单元格	原核融合之前
24小时	1个单元格	原核融合
46小时	2个单元格	2单元格（82％）
62-63小时	2-4细胞	2细胞（16％），4细胞（49％）和4细胞+（35％）
96 h	10-26 cell	> 90％
114小时	32-64单元格

检查胚胎在显微镜下确保胚胎发育到所需阶段注意：通过8个细胞发育阶段的胚胎可以通过光学显微镜进行轻松分期，而后期阶段通常需要通过荧光显微镜进行DAPI核染色来定义细胞数量和发育阶段（Wang等，2014）。

胚胎壳（外套）去除蛔虫胚胎
1. 在室温下，在1550或50ml Falcon管中以1,250×g的颗粒胚（来自步骤A2）5分钟。去除上清液
2. 以15-20倍的丸粒体积重新悬浮胚胎或50ml新鲜制备的0.4N KOH/1.4％次氯酸钠（溶液应预热至30℃）。
3. 将悬浮液转移回原来的三角烧瓶中，并在30℃下在培养箱摇床中以100rpm摇动孵育90分钟。
4. 在1550或50毫升Falcon管中以1,250×g的颗粒胚在室温下5分钟。
5. 用15-20倍小粒体积的冰冷的PBS，pH7.0，通过如步骤A1d轻轻重新悬浮和离心，洗涤胚胎5次。
6. 从胚胎胚胎估计包装胚胎体积。脱漆后最终胚胎的体积通常为起始体积的约60％（见图4A和4B）。
  
  图4.蛔虫胚胎 A.一个细胞阶段蛔虫胚胎。在胚胎膜外面有厚厚的壳多糖壳（外套）。 B.除虫后的一个细胞阶段蛔虫胚胎。去除壳多糖壳，仍然存在胚胎膜。 C.蛔虫匀浆后的胚胎。

准备用于细胞核分离的蛔虫组织
1. 蛔虫解剖
  蛔虫可以从猪屠宰场收集并置于30℃PBS（pH7.0）中，同时运送到实验室。将蠕虫保持在30°C以维持生命力是很重要的。
  注意：蛔虫可以在30℃PBS，pH 7.0中保存至少2-3天。然而，最好在同一天解剖蠕虫以获得新鲜的组织。
  1. 用温热的PBS，pH 7.0冲洗蠕虫。
  2. 可以解剖睾丸，以获得精子细胞，肠，睾丸和剩余的组织（包括肌肉，皮下组织，咽和神经元的胴体）。女性蛔虫可以解剖以获得卵巢/输卵管，卵母细胞，子宫，肠和胴体。组织应在液氮（不含PBS）中冷冻，并储存于-80°C。请注意，生殖系统长达一米，可以识别和细分不同的区域进行分析。
核分离
1. 从蛔虫胚胎进行核分离。
  1. 将约900μl脱蛋白的胚悬浮于10ml细胞核提取缓冲液A中，并在4℃下以1,200×g离心5分钟。请注意，可以从〜1毫升包装的脱色胚胎（〜20成熟女性蛔虫）获得约1000万个胚胎。核的数量将取决于胚胎的发育阶段。（不同类型实验所需的核数量见表2）
    表2.蛋白质，RNA和DNA含量作为蛔虫细胞核和ChIP实验所需的量
    
    实验
    核蛋白（10μg）
    核RNA（10μg）
    DNA（10 ng）
    ChIP/ChIP-seq
    
    核 -
    〜10 ⁵
    〜10 ⁵
    〜10 ⁴
    〜10 ⁶
  2. 去除上清液。将900μl细胞沉淀重悬于含有0.5 mM PMSF和cOm完全蛋白酶抑制剂混合物的10 ml冰冷核提取缓冲液B中。将悬浮液转移到保持在冰上的15ml WHEATON金属均质器中。
  3. 均匀10次。
    注意：在显微镜下检查胚胎，以确保超过80％被破坏。如果没有，进一步均质（见图4C）。
  4. 将悬浮液转移到15ml Falcon管中，并在Sorvall Legend XT中用旋转叶轮转子在4℃下以750×g旋转10分钟。去除上清液 注意：
    1. 上清液中的细胞核数量（等效体积）的比较应该显示细胞核中的非常高的核富集（一些细胞核保留在上清液中）。
    2. 如果要收集细胞质提取物，请保留上清液。对于细胞质提取物，我们通常以21,000 x g在4℃澄清上清液15分钟，将分批转移到预冷却的微量离心管中，将管冷冻在液氮中，并储存在-80℃。
  5. 将核颗粒重悬在10ml冰冷的核提取缓冲液A中，在具有摆动的桶式转子的Sorvall Legend XT中，在4℃下以750×g离心10分钟。重复两次，然后3小时离心步骤从核沉淀中除去尽可能多的上清液。
  6. 将沉淀物重悬于10ml冰冷核提取缓冲液C中，在旋转桶转子的Sorvall Legend XT中以4℃在2,000×g下离心15分钟。去除上清液并检查核上清液。大多数核应该是颗粒。
  7. 分离的核可以立即使用或在液氮中储存缓冲液中冷冻，并储存在-80°C进行未来实验。
    注意：参见步骤C中分离蛔虫胚胎，胚胎分离和用于细胞核分离的胚胎的制备。
2. 从蛔虫组织中的核分离
  1. 来自3-5个蠕虫（〜10 ⁵ -10 ⁶细胞核的蛔虫组织取决于组织的差异）与细粉中的细粉使用砂浆和杵的液氮。（见表2中核的量应用于不同的实验目的。）
  2. 在10毫升冰冷的PBS中洗涤蛔虫组织粉末，并在4℃下以1,200×g离心5分钟。
  3. 重复步骤C2b两次。
  4. 隔离核，如上述程序A所述注意：每个步骤的缓冲液体积应根据组织粉末的体积进行优化，使用与去皮胚胎相同量的缓冲液。

笔记

解决1500个蠕虫需要4-5个小时的2人。为了有效的解剖和预防细菌生长，请在蠕虫后立即分离胚胎，并保持冷。
已知蛔虫在人体中引起感染;因此应遵循适当的预防措施，以保护您和其他实验室成员免受感染。据报道，蛔虫蛔虫蛔虫可以感染导致肺部感染的人。从女性蛔虫中分离鸡蛋不是直接的感染威胁。蛔虫的感染阶段是卵内发育的L2/L3阶段。从女性子宫中分离的蛔虫需要在30℃下开发3-4周才能适当曝气以成为感染性的。因此，如果胚胎没有被胚胎传染给感染性幼虫，那么它们不会产生感染风险。虽然不太可能和非常罕见，但仍然有可能在与女性子宫隔离期间发生一些鸡蛋污染。因此，保护实验室工作人员的安全协议，包括个人保护装置，专用工作场所，与蛔虫接触的材料的灭菌，以及治疗长凳和材料以去除蛔虫鸡蛋以防止其发展成为感染阶段。最后，暴露于成虫可能导致过敏性休克。应向实验室人员通报所有与蛔虫有关的风险，包括过敏性休克及其治疗的症状。此外，作为预防措施，人们应与活的成年蠕虫成对配对，以确保另一人在有人发生过敏性休克的情况下存在。
根据细胞核的组织和大小，该协议可以修改和优化，以与其他线虫一起使用
大规模的蛔虫允许不同部分的蠕虫组织被分离并用于核提取。然而，对于大多数其他小线虫，整个蠕虫用于核分离。

食谱

PBS缓冲液
8克NaCl
0.2克KCl
1.44g Na 2 HPO 4
0.24g KH 2 PO 4
添加ddH ₂ O至1 L
用HCl将pH调至7.0或2.0
1M Tris-HCl，pH7.8。
15ml 1M Tris-HCl，pH7.0
16ml 1M Tris-HCl，pH8.0
KOH /漂白剂（0.4N KOH/1.4％次氯酸钠）
35.2ml次氯酸钠溶液
2.24克KOH
将ddH ₂ O加至100 ml
核提取缓冲液A
1.5mM MgCl 2
1 mM EGTA
0.5 M蔗糖
10 mM KCl
20mM Tris-HCl，pH7.7
1 mM DTT
1mM精胺
1mM亚精胺
将ddH ₂ O添加到所需的最终卷
核提取缓冲液B
将列表添加到核提取缓冲区A
0.15％NP-40
0.1％Triton X-100
将ddH ₂ O添加到所需的最终卷
在使用之前先添加0.5 mM PMSF和1x cOmplete™蛋白酶抑制剂混合物
核提取缓冲液C
1.5mM MgCl 2
1 mM EGTA
1 M蔗糖
10 mM KCl
20mM Tris-HCl，pH7.7
1 mM DTT
1mM精胺
1mM亚精胺
将dd H <2> O加入到所需的最终体积
核存储缓冲区
40％甘油
50mM Tris-HCl
5mM MgCl 2
0.05％2-巯基乙醇
1 mM DTT
1 mM EDTA
将ddH ₂ O添加到所需的最终卷

致谢

这项工作得到NIH授予R.E.D.的部分支持。（AI0149558和AI114054）。

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