材料和试剂

无菌牙签
圆底聚苯乙烯管，14毫升（购买无菌）（康宁，目录号：352051）
蓝色螺旋盖管，50ml（购买无菌; Cellstar）
螺旋盖管，2毫升（购买无菌; SARSTEDT）
PCR管，0.2ml，平盖（通过高压灭菌灭菌）（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：I1402-8100）
硝酸纤维素转移膜，BioTrace ^{TM NT（Pall，目录号：66485）}
1.5毫升螺旋盖管
Minisart ^®注射器过滤器，非致热原，0.2μm（Sartorius）
注射器滤芯w /0.45μm聚醚砜膜（VWR，目录号：28145-503）
印刷纸（VWR，印迹垫707）
培养皿55毫米（购买无菌）（Greiner Bio One International，目录号：628102）
120 x 120毫米（购自无菌）的方格培养皿（Greiner Bio One International，目录号：688102）
过滤嘴10,200,1000μl（生物圈 Plus，用于微量移液器，SARSTEDT）

在mbSUS测定中使用的酵母菌株（表1）
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
表1.用于mbSUS测定的酵母菌株

名称	基因型	功能	参考
THY.AP4	，leu2 ^- ，trp1 ^- br /> ura3 ^- ; lexA :: ADE2， lexA :: HIS3，lexA :: lacZ	诱饵：携带Y- 在向量中的CubPLV pMetYC-Dest	（Obrdlik等人，2004）
THY.AP5	MAT URA3; ，leu2 ^- ，trp1 ^- >	猎物：携带 NubG-X在向量中 pNX35-Dest或NubWt	（Obrdlik等人，2004）

在mbSUS测定中使用的目的载体（表2）

表2.用于mbSUS测定的目标载体

矢量名称	促销者	网关站点	功能	参考
pMetYC-Dest	met25	attR1，attR2	融合蛋白与C-末端 CubPLV作为诱饵;合成 LEU在酵母中	（Grefen等人，2009）
pNX35-Dest	ADH1	attR1，attR2	融合蛋白与N-末端 NubG为猎物;合成酵母中的TRP	（Grefen和Blatt，2012）

供体载体：pDONR207载体（Thermo Fisher Scientific）或其他供体载体含有attP1，attP2网关盒
网关^®克隆酶：

BP克隆酶 II酶混合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11789020）}
LR Clonase ^® II酶混合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11791020）}

蛋白梯（Pageruler Plus Prestained Protein Ladder，Thermo Fisher Scientific）
Western印迹信号检测试剂盒（SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：37071）}
抗体解决方案
1. 主要：抗-HA（1：20,000，抗HA高亲和力大鼠单克隆抗体）（Roche Diagnostics，目录号：11867423001）或抗VP16（1：20,000，Rabbit中的抗VP16标签抗体）（Abcam，目录号号码：ab4808）
2. 次级：抗兔HRP（1：20,000，山羊抗兔IgG-HRP）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：G-21234）或抗大鼠HRP（1:2000 ，兔抗大鼠IgG H& L [HRP]）（Abcam，目录号：ab6734）
甲硫氨酸
甘油（Fisher Scientific，目录号：10795711）
蛋白胨（Formedium ^TM，目录号：PEP02）
葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：10141520）
酵母提取物（Formedium ^TM，目录号：YEA02）
氧化物琼脂（琼脂1号）（Oxoid，目录号：LP0011）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：60377）
乙酸锂二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：L4158）
去离子水
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：1.00063）
鲑鱼精DNA（ssDNA）（Sigma-Aldrich，目录号：31149）
聚乙二醇3350（Spectrum Chemical Manufacturing，目录号：Po125-500gm）
YNB无硫酸铵，无钾（MP Biomedicals，目录号：114029622）
正磷酸二氢钾（Fisher Scientific，目录号：10783611）
CSM-ADE-HIS-LEU-MET-TRP-URA（粉末）（MP Biomedicals，目录号：114560222）
琼脂
硫酸亚铁（Sigma-Aldrich，目录号：A3159）
尿嘧啶（Sigma-Aldrich，目录号：U1128）
L-亮氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L8912）
L-色氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T4196）
L-组氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：H3911）
L-甲硫氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：M5308）
十二烷基硫酸钠（SDS）（VWR，目录号：442444H）
尿素（Sigma-Aldrich，目录号：U5378）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：43817或43815）
注意：产品"43817"已经停产。
丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：A8887）
溴酚蓝
过硫酸铵（Fisher Scientific，目录号：10020020）
TEMED（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
硫酸铵（VWR，目录号：21333.296）
Tris（Fisher Scientific，目录号：BP152-1）
甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：10070150）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
Ponceau S（Sigma-Aldrich，目录号：P3504）
氯化钠（VWR，目录号：27810.295）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
奶粉（Marvel，Iceland，UK）
YPD媒体（见配方）
LiAc溶液（参见食谱）
ssDNA溶液（参见食谱）
PEG溶液（参见食谱）
CSM-minimal媒体（见配方）
营养缺陷型选择试剂（见食谱）
SCM-营养缺陷型选择培养基（参见食谱）
'Lyse&加载'缓冲区（请参阅配方）
10％SDS-PAGE分离凝胶（参见食谱）
5％SDS-PAGE堆叠凝胶（见配方）
Bjerrums缓冲区（见配方）
Ponceau S解决方案（见配方）
TBS溶液和TBS-Tween溶液（参见食谱）
运行缓冲区（见配方）
阻塞解决方案（见配方）

设备

用于酵母在液体培养中生长的培养器振荡器（Sartorius，型号：BS1）
玻璃烧瓶500ml（通过高压灭菌灭菌）（Corning，PYREX ^{，目录号：4980-500）}
高速冷冻微量离心机（Eppendorf，型号：5417 R）
用于大体积液体样品的冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Sorvall TM} Legend ^TM RT）
PCR机（VWR，PEQLAB，型号：peqSTAR 96 Universal Gradient）
移液器
用于固体培养基板上酵母生长的培养箱（Gallenkamp，型号：Ipr150）
超声波破碎机（MSE，型号：Soniprep 150 MSS150.CX，9.5 mm探针）
生物光度计（Eppendorf，型号：Biophotometer Plus 6132）
SDS-PAGE凝胶电泳和印迹盒（Bio-Rad Laboratories，型号：Power PAC 1000和Mini-PROTEAN Tetra Cell）
Shakes for Western印迹（Stuart，型号：Stuart STR9 Gyro摇杆）
半干印迹系统（VWR，PEQLAB，型号：PerfectBlue ^{TM半干式印刷机）}
Western印迹成像平台（Vilber，型号：Fusion spectrum）
Vortex（科学工业，型号：Vortex-Genie 2）
成像系统
高压釜

程序

分子生物学
网关^®技术（Thermo Fisher Scientific，Germany）用于按照制造商的说明制备用于酵母mbSUS测定的质粒。分别将正向和反向引物中独特的attB1和attB2位点（B1 5'-3'：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct; B2 5'-3'：ggggaccactttgtacaagaaagctgggt）作为突出序列。为了将PCR产物与N末端标签融合在正确的阅读框架中，正向引物必须包含两个另外的核苷酸。根据目标载体，反向引物中包含终止密码子或载体本身。
随后的PCR产物通过BP反应插入到pDONR207载体中，以产生通过DNA测序验证的进入克隆。网关目的地克隆，pNX35-Dest for prey（Grefen和Blatt，2012）和pMetYC-Dest for bait（Grefen等人，2009），是通过使用LR Clonase 根据制造商的说明书在LR反应中进行
酵母转化
在无菌条件下进行酵母转化。为每次转化准备新鲜有效的酵母菌
1. 通过无菌牙签从长期库存中挑选THY.AP4和AP5酵母，或从储备板中挑取一个酵母菌落（见注释7），并在14 ml无菌圆底管中接种5ml YPD，并在振荡器中孵育过夜200 rpm，28°C
2. 在高压灭菌的500ml烧瓶中用5ml过夜培养物接种45ml YPD，并以200rpm，28℃振荡孵育3-5小时，直到OD 600至0.6-0.8。
3. 通过在50ml蓝色螺旋盖管中离心（在2,000 xg，4℃下10分钟）收获细胞并弃去上清液。
4. 用20ml无菌水洗涤细胞，再次离心，弃去上清液
5. 用1.8ml的0.1M LiAc将细胞重新悬浮并转移到2ml Eppendorf管中，向下旋转（30℃，2,000xg，4℃），并弃去上清液。
6. 加入适量的0.1M LiAc（将转化次数乘以20μl），并在室温下孵育30分钟。
7. 同时，为每次转化制备具有10μlssDNA和5μl质粒DNA（目的克隆，> 100ng /μl）的无菌PCR管。
8. 准备主混合物：每次转化，混合70μlPEG溶液，10μl1M LiAc和20μl感受态酵母（来自步骤B6）。
9. 将主混合物与步骤B7的DNA混合物混合。
10. 在PCR机中，在30℃孵育30分钟，然后用移液管和热休克细胞在43℃下轻轻混合30分钟。
11. 将酵母以2,000 x g的速度旋转1分钟，然后将其从细胞中移出细胞，弃去上清液。
12. 用100μl无菌水清洗细胞，旋转下来，弃去上清液。
13. 将细胞重悬在50μl无菌水中并在适当的选择培养基上培养
14. 在28℃孵育48-72小时。每个板块至少有100个殖民地。
mbSUS分析
mbSUS测定在无菌条件下进行。
1. 选择携带猎物构建体的转化THY.AP5酵母的5-15个菌落并接种在3ml CSM-TUM培养基中。在培养箱振荡器中以200 rpm，28°C生长过夜。
2. 选择携带诱饵构建体的转化的THY.AP4酵母的5-15个菌落，并接种在3ml CSM-L1M培养基中。在培养箱振荡器中以200 rpm，28°C生长过夜。
3. 从每个诱饵和猎物酵母培养物中保留750μl作为储存培养物储存（参见酵母储备制备注）。
4. 通过在室温下以2,000×g离心收获酵母细胞1分钟，并将沉淀重悬于YPD培养基中（对于每个配对，应计算20μlYPD培养基）。
5. 在灭菌的PCR管中混合20μl各种酵母（携带诱饵）和酵母（携带猎物），并立即将4μl的每种配对酵母放在YPD板上。在28°C孵育过夜。
6. 使用无菌牙签将配对的酵母从YPD板转移到CSM 板上（图2A）。在28°C过夜生长。
  
  图2. mbSUS测定的实施例。A.用无菌牙签将酵母从YPD培养基转移到CSM 钠板上。 B.酵母被放在CSM -LTUMAH 板上，纸上有黑点。将表达KAT1-CubPLV的二倍体酵母作为饵料，将VAMP721，VAMP723和对照（阴性：NubG;阳性：NubWt）作为猎物的NubG-X融合物点样到不同的培养基上，如图所示。 CSM _-LTUM用于验证饵料和猎物载体的存在。使用不同浓度的甲硫氨酸（Met）与CSM -LTUMAH 相结合，以证明当K ^{+/sup> channel-CubPLV表达被抑制时的相互作用。在每种情况下，二倍体酵母以1.0和0.1 OD 600滴下。 CSM 板的孵育时间为24小时，CSM-LTUMAH板的孵育时间为72小时。对于mbSUS使用的二倍体酵母的蛋白质印迹分析用用于VAMP融合物的商业HA抗体和K ⁺通道融合体的VP16抗体进行。 Ponceau S污渍被用作印迹/加载控制（右）}
7. 从CSM 板中挑取每个样品的配对酵母菌落，并接种于3ml液体CSM 培养基中，在培养箱振荡器中以200rpm，28 °C。
8. 接种1ml的配对细胞到3ml新鲜的CSM 培养基中，并以200rpm，28℃生长4-6小时，用于随后的Western印迹分析。
9. 确定来自步骤C7的酵母细胞的OD <600>。
10. 通过在室温下2000分钟离心收获来自步骤C7的100μl剩余的细胞，并在无菌水中分别稀释至OD 600和1.0和0.1。 />
11. 在具有不同甲硫氨酸浓度（0.5,5,50和500μM;图2B）的CSM _-LTUM和CSM 平板上涂抹4μl每种稀释液，生长他们在28°C。分别检查在CSM <！ - SIPO - >板和CSM-L1TMAMAH板上生长1天和3天后的生长。图2C显示了mbSUS测定的一个实例，其表明VAMP721和KAT1K信号通道之间的相互作用，并且VAMP723和KAT1之间没有相互作用（Zhang等人，2015）。含有NubWt作为猎物的二倍体酵母作为阳性对照，含有NubG作为牺牲品的酵母是阴性对照。在良好的mbSUS测定中，阴性对照样品在CSM-L1TMAMAH板上显示较弱或无酵母生长，而酵母菌在阳性对照样品中生长良好（图2C）。
酵母蛋白提取用于Western印迹分析
蛋白质印迹分析

笔记

当使用蛋白质融合物时，天然蛋白质与Y-CubPLV融合体的C-末端应位于胞质溶胶中，并且捕获的NubG-X融合体也应在细胞质溶胶中可用，以进行有效的相互作用。 Cub和Nub的重组然后导致PLV部分的切割，并允许该转录因子移动到细胞核中。

小于40kDa的大分子可被动地扩散通过核孔，一些较大的颗粒也能够通过孔的大直径（Marfori等人，2011）。因此，诱饵蛋白通常会锚定在膜上。否则可溶性诱饵融合物可能会进入核心，并激活报告基因，与任何相互作用和PLV切割无关。 Preys融合不需要被膜锚定。

诱饵载体pMetYC-Dest中的融合蛋白的表达在met25启动子的控制下，其抑制培养基中甲硫氨酸存在下的表达（Grefen等人，2009）。然而，我们对mbSUS测定的经验表明，不含外部甲硫氨酸的培养基上的酵母生长比添加5μM甲硫氨酸的培养基上的酵母慢。为了克服这个问题，建议在介质中加入0.5μM甲硫氨酸。通过降低诱饵表达，可以使用较高的浓度（高达1mM Met）来测试相互作用中的特异性

在酵母脱落之前，建议让培养基板干燥。允许板的表面在无菌条件下干燥30分钟。板中固体介质的干燥表面有助于保持酵母斑点。

当放酵母时，建议用纸上的黑点打印滴纸方案，将其贴在纸板下方，如图2B所示。

对于蛋白质印迹分析，我们建议酵母不被培养过夜。从之前的过夜生长中将3ml新鲜培养基加入到1ml酵母培养物中，并允许培养物在收获前再生长4-6小时。这种方法避免了可能导致降解蛋白质并导致差的蛋白质印迹结果的培养物中衰老酵母的可能性。

为了制备长期储存的酵母菌液，移取750微升新鲜的过夜酵母培养物（来自步骤C1或C2），并在1.5ml螺旋盖管中加入250μl无菌60％甘油，紧紧关闭盖子并在冷冻之前混合在-80℃。建议每6个月更新一次甘油储备，避免甘油储备的反复冻融循环。为了从甘油原料中回收酵母细胞，使用无菌牙签挑取冷冻的酵母细胞，滴落并铺在合适的选择性培养基固体板上，然后在28℃下孵育24-48小时。选择性培养基上的酵母菌落准备用于mbSUS测定，酵母菌落可以在4℃下储存长达1个月。为了制备用于短期储存的酵母菌液，移取5-10μl新鲜的过夜酵母培养物（来自步骤C1或C2）或从甘油储备中挑取冷冻的酵母细胞;并将细胞放入合适的选择性固体培养基上。培养酵母在28℃24-48小时，然后在4℃下储存长达1个月。

食谱

YPD媒体
2％蛋白胨
2％葡萄糖
1％酵母提取物
2％琼脂
用1N KOH调节pH至6.0 通过高压灭菌消毒并在4℃下储存

LiAc溶液（1M或0.1M）
将乙酸锂溶解在去离子水中。用乙酸将pH调节至7.5，通过过滤灭菌（Minisart 注射器过滤器）并在室温下储存

ssDNA溶液
将10 mg/ml ssDNA溶解在去离子水中，通过过滤灭菌（Minisart注射器过滤器），并在使用前在冰上冷却后煮沸5分钟。储存于-20°C

PEG溶液
将PEG 3350在去离子水中溶解至最终浓度为50％（w/v），通过过滤灭菌（0.45μm聚醚砜膜），并避免储存期间的水分损失，因为这显着降低了转化效率。在室温下存放

CSM-minimal media
0.7g/L YNB（不含硫酸铵，不含钾）
5克/升硫酸铵
1g/L正磷酸二氢钾
20 g/L葡萄糖
0.55g/L的CSM脱落混合物，用新鲜制备的KOH调节pH至6.0 如果需要固体培养基，则加入20 g/L琼脂。 YNB和CSM脱水混合物除了所需的选择性物质外还含有所有氨基酸。通过高压灭菌消毒并在4℃下储存

用于营养缺陷选择的试剂
通过将以下每种化学品溶解在100ml水中制备，通过过滤灭菌，并在4℃的黑暗中储存：
ADE：0.4克腺嘌呤硫酸盐（每升培养基加5ml）
URA：0.4g尿嘧啶（每升培养基加5ml）
LEU：2.0g L-亮氨酸（加入5ml /升培养基）
TRP：0.4g L-色氨酸（加入5ml /升培养基）
HIS：将0.4g L-组氨酸（加入5ml每升培养基）
MET：1.5g L-甲硫氨酸（等于0.1M储备溶液，加入适量以得到0.5,5,50和500μM终浓度）

CSM-营养缺陷选择媒体
如下所示，通过将营养缺陷型选择（见方案6）的试剂加入到CSM基本培养基中并在高压灭菌后冷却至约50℃来制备CSM-营养缺陷型选择培养基（表3）：

表3.用于mbSUS测定的SC-营养缺陷型选择培养基

媒体	营养缺陷选择试剂	评论
CSM 媒体	ADE，他的，LEU	在THY.AP5中转化Nub克隆。
CSM _-LM媒体	ADE，HIS，TRP，URA	在THY.AP4中转化Cub克隆。
CSM _-LTUM媒体	ADE，他的	酵母交配检查
CSM _-LTUMAH媒体与Met	MET	酵母生长检查;不同的蛋氨酸浓度有助于提高信噪比

'Lyse&加载缓冲区
50mM Tris-HCl（pH6.8）
4％SDS
8 M尿素
30％甘油
0.1 M DTT
0.005％溴酚蓝
储存于-20°C
10％SDS-PAGE分离凝胶（50ml） 17ml丙烯酰胺（30％）
12.5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8）
0.5 ml 10％SDS
0.5ml 10％过硫酸铵
0.05 ml TEMED
将ddH ₂ O添加到50 ml
5％SDS-PAGE堆叠凝胶（50ml）
8.3毫升丙烯酰胺（30％）
6.3ml 1M Tris-HCl（pH6.8）
0.5 ml 10％SDS
0.5ml 10％（NH 4）2 N 2 S 2 O 8// 0.05 ml TEMED
将ddH ₂ O添加到50 ml
Bjerrums缓冲区
6.1 g/L Tris
2.4 g/L甘氨酸
20％甲醇
储存于4°C
Ponceau S解决方案
2g/L Ponceau S在5％乙酸中在室温下存放
TBS溶液和TBS-Tween溶液
8克/升NaCl
0.2克/升KCl
3克/升Tris
用HCl调节pH至7.4
在室温下存放
添加吐温^® 20至终浓度0.1％，使TBS-Tween
运行缓冲区
3克/升Tris
14.4g/L甘氨酸
1.5克/升SDS
在室温下存放
阻塞解决方案
TBS-Tween溶液中的5％奶粉

致谢

该协议从先前的出版物（Grefen等人，2009）进行了修改和修改。我们感谢Michael Blatt教授在准备这篇文章时的建议和支持。我们感谢Emily Larson博士的有用建议。这项工作得到泰国皇家政府奖学金的支持，WH（ST4718），中国奖学金委员会对BZ的奖学金，以及BBSRC拨款BB/I024496/1，BB/K015893/1，BB/L001276/1，BB/Prof. Blatt的M01133X/1，BB/M001601/1和BB/L019205/1。

参考

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