材料和试剂

50ml一次性聚丙烯管
试管（Iwaki，目录号：TEST30NP）
20 ml顶空瓶（GL Sciences，目录号：1030-46026）
22 G x 1"针（Terumo Medical，目录号：NN-2225R）
22 G x 1½"针（Terumo，目录号：NN-2238S）
铝箔
SupraPure亲水性PVDF注射器过滤器（Recenttec，目录号：R7-PVDF033S022I）
目标DP小瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：C4000-1）}
螺旋盖（GL Sciences，目录号：1030-45261）
300μl目标聚合物插入物（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：C4010-S630）}
一次性注射器（Terumo，目录号：SS-10LZ）
开口式铝合金帽，带丁基橡胶隔垫（Systech，目录号：98552）
MF-Millipore膜过滤器（Merck Millipore，目录号：HAWP03700）
蓝藻属集胞藻PCC 6803
氯化铵（NH 4 Cl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-02995）
60％高氯酸（HClO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：160-05755）
三氯乙酸
琥珀酸盐
乳酸盐
柠檬酸（Nacalai Tesque，目录号：09109-85）
醋酸盐
柠檬酸铁铵
Na 2 EDTA（Nacalai Tesque，目录号：15111-45）
硝酸钠（NaNO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：195-02545）
磷酸氢二钾（K 2 N 2 HPO 4）（和光纯药工业公司，目录号：164-04295）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（和光纯药，目录号：131-00405）
氯化钙脱水（CaCl 2·2H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：031-00435）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Nacalai Tesque，目录号：31311-25）
硼酸（H 3 BO 3/3）（和光纯药工业公司，目录号：021-02195）
四水合氯化锰（MnCl 2·4H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：139-00722）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：264-00402）
五水合硫酸铜（CuSO 4·5H 2 O）（和光纯药，目录号：039-04412）
钼酸钠脱水（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（和光纯药工业株式会社，目录号：196-02472） >
（H 2 SO 3 SO 4）（和光纯药工业公司，目录号：199-15995）
硝酸钴六水合物，Co（NO 3 3）2·5H 2 O（和光纯药工业公司，目录号：031-03752）
HEPES（Dojindo Melecular Technologies，目录号：342-01375）
氢氧化钾（KOH）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：168-21815）
溴百里酚蓝（BTB）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：027-03052）
乙醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：057-00451）
磷酸氢二钠十二水合物（Na 2 HPO 4·12H 2 O）（和光纯药工业公司，目录号：196-02835）
琥珀酸（和光纯药，目录号：190-04332）
DL-乳酸锂盐（MP Biomedicals，目录号：100824）
乙酸钠（和光纯药，目录号：190-01071）
改良的BG-11液体介质（见配方）
流动相（3mM HClO 4）（参见食谱）
反应溶液（15mM Na 2 HPO 4中的0.2mM BTB）（参见食谱）
500mM琥珀酸溶液（参见食谱）
500 mM乳酸盐溶液（见配方）
500 mM柠檬酸溶液（见配方）
500 mM醋酸溶液（见食谱）
1 M醋酸溶液（见配方）

设备

栽培室（TOMY数字生物学，型号：CLE-303）
气体混合器（KOFLOC，型号：RK120XM）
空气泵（Yasunaga，型号：LP-30A）
分光光度计（Shimadzu，型号：UV-2700）
高速冷冻微量离心机（TOMY数字生物学，型号：MX-305）
N 2发电机（Sanyo Denshi，型号：SN4-4）
旋转振动筛（Nissin，型号：NX-20D）
冷冻干燥机（东京Rikaikai，EYELA，型号：FDU-2200）
超声波清洗机（SND，型号：US-108）
高压釜
HPLC系统（JASCO International，型号：LC-2000Plus）由以下设备组成：
1. 光电二极管阵列（PDA）检测器（JASCO International，型号：MD-2018Plus）
2. 智能型HPLC泵（JASCO International，型号：PU-2080Plus）
3. 线式脱气机（JASCO International，型号：DG-2080-53）
4. 三元梯度单位（JASCO International，型号：LG-2080-02）
5. 智能立柱炉（JASCO International，型号：CO-2065Plus）
6. 智能自动进样器（JASCO International，型号：AS-2057Plus）
7. 离子排除柱（300×8.0mm）（GL Sciences，型号：RSpak KC-811，目录号：5055-13509）和保护柱（10×4.6mm）（GL Sciences，型号：GPC KF-G，目录号：5055-13150）
8. 反应线圈单元（JASCO International，型号：RU-2080-51）

软件

ChromNAV软件（Ver。1.14）

程序

光照培养，需氧（a）和黑暗培养，厌氧条件（b）

集胞藻的葡萄糖耐量菌株（称为GT）由Williams（1988）分离的PCC 6803在补充有5mM NH 3的BG-11 液体培养基（Rippka，1988）的改良的BG-11培养基（参见食谱）中培养> 4 Cl（用20mM HEPES-KOH缓冲，pH7.8）。在我们的研究中，使用了GT-I株（Kanesaki等人，2012）。使用气体混合器（RK120XM，KOFLOC）和空气泵（LP-30A）将GT细胞在含有1％（v/v）CO 2的空气中的液体改性BG-11培养基中培养， Yasunaga）以30-50ml/min的流速，在培养室（CLE-303，TOMY）中。将温度保持在30℃，在50-70μmol光子·m ^-2 sec ^{-1连续供给白光。使用Shimadzu UV-2700分光光度计在 730 测量细胞密度。细胞培养在70ml改良的BG-11培养基（起始于730）中，在轻，有氧条件下培养3天。轻，有氧培养影响琥珀酸和乳酸的含量，每个实验室都需要优化培养条件。}
通过以5,600×g离心离心收集细胞2分钟，并浓缩成10ml HEPES缓冲液（20mM HEPES-KOH，pH7.8）或修饰的BG-11以达到A ₇₃₀（图1）。将小瓶用带有丁基橡胶隔片的开放式铝盖密封，并通过隔膜刺穿两针（针22 G x 1"和针22 G x 1 1/2"）。 22G×1 1/2"针连接到N 2气体发生器以引入N 2气体30-60分钟以产生厌氧条件。
在引入N 2气体后，取出针，并用铝箔包裹小瓶。将细胞在30℃下在旋转振荡器上以160rpm摇动孵育1-5天。 1天，琥珀酸盐和乳酸盐从细胞中排泄较少。在长时间的孵育期间，琥珀酸和乳酸水平升高，但是在3或4天达到最大值，并在5天开始下降（Osanai等，2015）。

图1.用于厌氧培养的20ml小瓶。将细胞浓缩至10ml缓冲液或培养基中以达到730℃/ 20，然后用丁基橡胶帽密封小瓶。将两个注射器插入帽中，并通过两个注射器之一引入N 2气体30-60分钟。在引入N 2气体后，取出注射器，将小瓶包裹在铝箔中以保持黑暗状态。

HPLC分析样品制备

孵育后，用开瓶器除去带有丁基橡胶的铝盖。细胞培养物以5,600×g离心2分钟。使用SupraPure无菌注射器过滤器，过滤上清液以除去碎屑
然后将1ml上清液转移到2ml塑料管中。将上清液置于烧瓶中，并在-80℃下用FDU-2200冷冻干燥器干燥1天。冷冻干燥的样品用100μl3mM高氯酸（HClO 4）分解（由于HClO 4高度腐蚀性，应小心处理）并离心在5,600×g下进行2分钟。
然后，使用玻璃插入物将100μl上清液转移到Target DP小瓶中。将其置于自动进样器进行HPLC分析。
在含有大量蛋白质的样品的情况下，冷冻干燥的样品应在97μl3mM HClO 4和3μl100％三氯乙酸中分解。充分混合，然后以20,400 x g离心样品10分钟。使用上清液进行HPLC分析
为了制备标准品，混合100μl500mM琥珀酸盐溶液，160μl500mM乳酸盐溶液，100μl500mM柠檬酸盐溶液，200μl1M乙酸盐溶液（参见Recipes）和440μldH 2 O组成总共1ml有机酸标准品。该解决方案命名为STD1。 STD1中每种有机酸的最终浓度为80mM乳酸盐，50mM琥珀酸盐，50mM柠檬酸盐和200mM乙酸盐。
稀释STD1以绘制分析曲线的浓度范围。

HPLC分析
有机酸的定量通过使用用BTB进行后标记的HPLC进行（图2）。使用3mM HClO 4溶液作为流动相和0.2mM BTB在15mM Na 2 HPO 4·4溶液中作为反应溶液。使用超声波清洗机和吸气器将流动相和反应溶液脱气约20分钟。 HPLC测量在以下条件下进行：

智能型HPLC泵（流动相）：流量设定为0.7ml/min。该泵连接线路脱气器和三元梯度单元，并进一步连接到智能柱箱。样品注射前，用流动相平衡柱，流速相同，流速为1小时
智能型HPLC泵（反应溶液）：流量设定为1.2ml/min
智能柱箱：柱温60°C
智能自动进样器：取样器温度为4°C，进样体积为20μl。要清理注射针，请使用HClO 4溶液。在样品注入前用HClO 4冲洗三次。
反应线圈单元用于混合流动相，包括样品和BTB溶液
PDA：具有氘（D 2子）和卤素（W）灯的单光束光度计;使用200-900nm波长范围内的扫描，进行42分钟的单次数据分析。开始HPLC分析之前，请等待大约60分钟，直到流量稳定（基线没有漂移和噪音）

图2.使用溴百里酚蓝标记后的HPLC分析示意图。两种HPLC泵分别用于流动相和BTB溶液。样品注射自动进样器并除以尺寸排阻柱，然后与BTB溶液混合。有机酸通过PDA检测器检测，并通过ChromNAV软件进行分析。

数据分析

通过HPLC测定的经BTB标记后的典型色谱图如图3所示。有机酸峰使用445nm处的吸光度进行定量。使用ChromNAV程序来量化每种有机酸的峰面积。通过用已知浓度样品的点标记来绘制每种有机酸的标准曲线。使用以下标准曲线计算样品中有机酸的浓度（图4）

图3.用标记后的溴百里酚蓝色的HPLC测量的典型色谱图。从波长445nm处的吸光度计算峰强度。每种有机酸的保留时间如下：柠檬酸盐17.55分钟，琥珀酸盐22.36分钟，乳酸盐23.80分钟，乙酸盐27.34分钟。

图4.琥珀酸（橙色）和乳酸（蓝色）的标准曲线。通过整合每种有机酸的峰面积，从色谱图计算强度值。

笔记

在含有大量蛋白质的样品的情况下，冷冻干燥的样品应在97μl3mM HClO 4和3μl100％三氯乙酸中分解。充分混合，然后以20,400 x g离心样品10分钟。使用上清液进行HPLC分析。

食谱

改良的BG-11液体介质（室温下储存）

解决方案1（存储在4°C）
称量0.6g柠檬酸，0.6g柠檬酸铁铵和0.1g Na 2 EDTA，并加入蒸馏水（dH 2 O 2）至200ml
解决方案2（存储在4°C）
称取30g NaNO 3，0.78g K 2 HPO 4，和1.5g MgSO 4·7H ₂ O，并将dH ₂ O添加到1L
解决方案3（存储在4°C）
称取3.8g CaCl 2·2H 2 O，并加入dH 2 O至200ml
解决方案4（存储在4°C）
称取4g Na 2 CO 3，并加入dH 2 O至200ml
解决方案5（存储在4°C）
称取2.86g H 3 BO 3，1.81g MnCl 2·4H 2 O，0.22g ZnSO 3 > 4 2 O，0.08g CuSO 4·5H 2 O，0.021g Na 2， sub> MoO 4，和50μlH 2 SO 4，并加入dH 2 O至1L（ 1 *）
称量0.0494g Co（NO 3 3）2< 2< 2> O并加入（1 *）
1 M HEPES-KOH，pH 7.8（储存于4°C）
称量119.1 g HEPES并加入dH 2 O至约400 ml
用6N KOH将pH调节至7.8，并加入dH 2 O至500ml
高压灭菌器（121°C 15分钟），并保存在4°C
K 2 2 HPO 4溶液（在4℃下储存）
称取0.39g K 2 H 2 HPO 4，并加入dH 2 O 2至200ml
MgSO 4·7H 2 O溶液（4℃保存）
称量0.75g MgSO 4·7H 2 O，并加入dH 2 O至200ml
混合20 ml 1M HEPES-KOH（pH 7.8），50ml溶液2,2ml溶液3,1ml溶液4和1ml溶液5，并加入dH 2 O至1L < br /> 高压灭菌混合物并在室温下储存使用前，加入2ml溶液1至1L混合物

流动相（3mM HClO 4 ）
称量0.5g 60％HClO 4，并加入dH 2 O至1L
用MF-Millipore膜过滤器过滤
反应溶液（15mM Na 2 HPO 4中的0.2mM BTB）
称量125 mg BTB，加入10ml乙醇（1）称取5.3g Na 2 HPO 4·12H 2 O，并加入到dH 2 O（2）
混合（1）和（2），并将dH <2> O添加到1L
用MF-Millipore膜过滤器过滤混合物
500mM琥珀酸溶液
称量590.45mg琥珀酸盐并加入10ml dH 2 O，使用量瓶
500 mM乳酸盐溶液
称量480.05mg DL乳酸锂盐，并使用量瓶将其加至10ml dH 2 O 3
500 mM柠檬酸溶液
称量960.6mg柠檬酸盐并加入dH 2 O至10ml，使用测量瓶
1 M醋酸溶液
称量820.3mg乙酸钠，并用量杯加入dH 2 O至10ml

致谢

这个协议是从以前的Ueda等人发表的研究中改编的。（2016）和Iijima等人。（2016）。这项工作得到日本教育，文化，体育，科技部的支持。来自日本科学技术厅（JSPS KAKENHI，创新地区科学研究资助项目名称（"转基因调节剂和昼夜节律钟基因工程遗传工程蓝藻琥珀酸盐生产项目名称"）（授权号16H06559 ）。

参考

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Iijima，H.，Shirai，T.，Okamoto，M.，Pinto，F.，Tamagnini，P.，Hasunuma，T.，Kondo，A.，Hirai，M.，T.and Osanai，T。（2016）。基于代谢组学的分析揭示了原代碳代谢的改变通过在集胞藻中的氢化酶HoxH的遗传操作。 PCC 6803. Algal Res 18：305-313。
Kanesaki，Y.，Shiwa，Y.，Tajima，N.，Suzuki，M.，Watanabe，S.，Sato，N.，Ikeuchi，M.and Yoshikawa，H。（2012）。< a class = ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22193367"target ="_ blank">通过大规模平行的全基因组重排序鉴定亚型特异性突变 sp。 PCC 6803。 DNA Res 19（1）：67-79。
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Rippka，R。（1988）。分离和纯化蓝细菌。 方法Enzymol 167：3-27。
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Williams，JGK（1988）。构建特定突变光合系统II光合反应中心通过遗传工程方法在集胞藻6803中。方法Enzymol 。 167：766-778。