材料和试剂

35毫米细胞培养皿与4内孔，每个直径为10毫米（Greiner Bio One国际，目录号：627170）
10厘米细胞培养皿（康宁，目录号：353003）
预冷（-20°C）组织培养移液管过滤嘴
10μl提示（Corning，Axygen ^®，目录号：TF-300-R-S）
200μl提示（Corning，Axygen ^{®，目录号：TF-200-R-S）}
1000μl提示（Corning，Axygen ^®，目录号：TF-1000-R-S）
5 ml血清移液管和移液器男孩（VWR，目录号：612-3702）
1.5ml Eppendorf微量离心管（VWR，目录号：211-0007）
3.2 ml一次性移液器（Thermo Fisher Scientific，目录号：BER202-1S）
1 ml带有可拆卸针头的胰岛素注射器（BD，目录号：329651）
冰盘和冰可用
小生物危害袋可用
用于标记细胞培养板的标记笔（例如，，Sharpie）
1-2日出生日C57Bl/6野生型小鼠（澳大利亚动物资源中心）或当地动物供应商
绝对乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：24102）
Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Sientific，Gibco ^{TM，目录号：14170112）}
生长因子减少Matrigel（康宁，目录号：356230）
Neurobasal培养基（Thermo Fisher Sientific，Gibco ^{TM，目录号：21103049）}
B27补充x50（Thermo Fisher Sientific，Gibco ^TM，目录号：17504044）
200mM谷氨酰胺（Thermo Fisher Sientific，Gibco ^{TM，目录号：25030081）}
青霉素/链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Sientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
重组鼠成纤维细胞生长因子（FGF）碱性1mg/ml（PeproTech，目录号：450-33）
重组鼠表皮生长因子（EGF）1mg/ml（PeproTech，目录号：315-09）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Chem Supply，目录号：SA026）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4·H 2 O）（Chem Supply，目录号：SO03310500）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S5881）
DAPI（Thermo Fisher Sientific，Gibco ^TM，目录号：D1306）
驴血清（Sigma Aldrich，目录号：D9663）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
山羊抗双皮质素（DCX）抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-8066或sc-271390）
注意：作者使用sc-8066，该抗体已被停用。来自Santa Cruz Biotechnology的建议替代品是sc-271390。
Cy3缀合的驴抗山羊抗体（Jackson ImmunoResearch，目录号：705-165-147）
80％乙醇溶液（参见食谱）
完成神经巴氏培养基（见食谱）
完整Matrigel（见食谱）
0.1M磷酸缓冲盐水（PBS）（参见食谱）
4％多聚甲醛（PFA）（见配方）
含有DAPI的PBS（参见食谱）
阻塞缓冲区（见配方）
一抗（见食谱）
二抗（见食谱）

设备

移液器
20微升移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：4642050）
200μl移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：4642080）
1,000μl移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：4642090）}
生物安全柜，任何品牌/型号
瓶，无菌玻璃或塑料，任何品牌，用于组织培养基储存
Millipore Stericup ^{TM无菌真空过滤器（EMD Millipore，目录号：SCGPU01RE）}
带有灯（或冷光源）的解剖显微镜（Olympus或类似物）
解剖剪刀，12.5厘米长，直（Coherent Scientific，目录号：15922）
虹膜剪刀10厘米长，30度角，超切（Coherent Scientific，目录号：500046）
敷料钳，15.5厘米长（相干科学，目录号：500363）
2 x杜蒙镊子＃3，12厘米长，0.08 x 0.04毫米尖（Coherent Scientific，目录号：500337）
解剖刮刀，140毫米长，3宽mm刀片（世界精密仪器，目录号：501772）
手术刀第15号手术刀第3号（Coherent Scientific，目录号：500236和500242）
Dumont镊子＃5，11厘米长，0.06 x 0.01毫米提示（Coherent Scientific，目录号：14095）
加湿组织培养箱（5％CO 2，37℃），任何品牌/型号
冰箱（4°C），任何品牌/型号
冰柜（-20°C），任何品牌/型号
倒置荧光显微镜和数码相机（Olympus，型号：IX81或类似）

软件

Axiovision软件v4.1（Zeiss，Thornwood，NY）或类似的
GraphPad Prism（v4.03）

程序

准备工作区
1. 使用80％乙醇消毒设备（参见食谱1），并放入生物安全柜：夹层工具，35 mm和10 cm培养板，培养瓶，血清移液管（5ml）和移液器 - 男孩，冰盘和冰，屏障移液器吸头和相关移液器和解剖显微镜。
2. 适当地标记所有必需的菜肴和管子。
脑解剖
1. 使用解剖剪刀（沿着绿色的虚线），使产后1-2天龄的C57Bl/6小鼠幼仔蜕皮（图1A）。将身体放入生物危害袋。
2. 使用虹膜剪刀剪下头皮上的皮肤（紫色箭头），并横向剥离暴露头骨。使用敷料钳和虹膜剪刀切掉多余的皮肤（图1B）
3. 使用虹膜剪刀，通过颅骨进行相同的切割，并且进行两个垂直切割（蓝色箭头;图1B）。使用Dumont镊子＃3剥离这些切口之间的头骨，以暴露下面的大脑。
  
  图1.在示意图和显微镜图像中描述的逐步解剖程序。 A-C。从1-2天老鼠小鼠中去除大脑; D-F。切分大脑，解剖RMS，并将RMS切割成直径约200-300μm的许多小块; G.在Matrigel中培养多达4个外植体，其中测试化合物保持在完整的Neruobasal培养基中。酒吧代表2毫米。
4. 使用刮刀的平坦部分，从大脑的尾端开始，轻轻地将脑部从头骨中提出（图1C）。将大脑放入含有5ml HBSS培养基的10cm培养皿中。将鼠标头放入生物危险袋中。
5. 使用两对Dumont镊子＃3，从嗅球开始轻轻地将脑膜从脑部拉出。
传播流（RMS）解剖和外植体生产
1. 使用Dumont镊子＃3来保持大脑稳定，使用大脑头端的解剖刀刀片切割整个大脑中的3-4个冠状切片（图1D）。当使用手术刀刀片时，使用温和的来回锯切运动来保持组织的形态。
2. 使用Dumont镊子＃5，将含有RMS（其也包括迁移的前室下区[aSVZ]成神经细胞）的两个脑半球的切片转移到含有冰冷HBSS的35mm培养皿中（图1E）。
3. 为了识别这些切片内的均方根，将光源定位在部分的中心，以使中心RMS与周围组织区分开。在早期出生后的鼠标中，RMS会比周围的组织显得更加半透明，黑暗和光泽。 RMS应位于中心位置，其最宽点约为冠状切片宽度的三分之一。
4. 使用两只胰岛素注射器针头，通过在其边界的内侧切割RMS来解剖RMS（图1E）
5. 使用相同的注射器针头，将RMS切割成大约200-300μm宽的许多小件，并放在一边（图1F）。
注意：
1. 作者没有使用组织/脑切片机将大脑切成3或4个冠状切片，尽管这种设备可以帮助其他人在整个大脑中切割更平直甚至切片。
2. 为了更好地可视化冠状切片中的RMS，重新排列光源可能很重要，以使RMS从周围组织变得更暗，因此可以更容易地区分。
3. 为了更好的实验分析，使用针将RMS切割成与大小和形状大致相同的片段。
4. 一个RMS可能产生多达50个外植体。
外部实验
1. 使用冰冷的移液管吸头和冰盘顶部，通过在完整的神经巴氏培养基中稀释Matrigel来制备完整的Matrigel（参见食谱3）（参见方法2）。为了产生不同的处理条件，最多可将2μl待测化合物加入稀释的基质胶中（图1G）。在冰上存放
2. 在装满冰的10厘米盘子中放置一个4孔盘，使Matrigel聚合之前的外植体操作时间更长。
3. 一次准备好一个，使用Dumont镊子＃5，仔细拿起外植体，放入4孔盘的一口。每孔平板四个RMS外植体，并使用10μl移液管除去过量的HBSS
4. 调低光源亮度以减少任何热量输出（或使用冷光源照明器）。
5. 使用手术刀刀片，修剪冰冷的移液管尖端，使开口更宽，并将100μl稀释的基质胶转移到一个孔中的外植体上。使用相同的尖端，轻轻地将基质胶与外植体混合（不产生任何气泡），确保外植体完全被凝胶包围。在此步骤中快速工作，否则凝胶将在显微镜灯的加热下开始聚合。
6. 使用Dumont镊子＃3，将外植体排列在Matrigel中，使它们彼此分开，并远离井壁。
7. 对其他井重复。
8. 将两个35毫米4孔的培养皿（含外植体和Matrigel）放在10厘米的培养皿中并孵育（5％CO 2，37℃）15分钟，以使Matrigel聚合。 br />
9. 聚合后，轻轻加入2毫升完整的神经细胞培养基，以覆盖Matrigel和外植体
10. 在潮湿的培养箱（5％CO 2，37℃）中维持培养72小时。
注意：
1. 为了防止Matrigel过早聚合，请确保在冰冷条件下使用细胞培养皿和在-20°C预冷的移液管吸头进行操作。
2. 将外植体在Matrigel中很好地混合，而不会产生任何气泡，并将外植体放置在彼此远离的井中，并远离井壁，以允许在所有方向迁移。 >
3. 一旦Matrigel和外植体已经放入井中，可能会难以移动Matrigel中的外植体。为了协助这个过程，一次准备好一口井。在井之间，可能需要关闭光源（即，消除任何热源）2-3分钟，并在解剖显微镜载物台的顶部放置装满冰的10厘米培养皿，以快速冷却。 em>
4. 使用标记笔，通过标注井1,2,3和4的底部来跟踪每个井中的4个外植体。
外植体免疫组织化学
1. 温热4％PFA（见配方5）至37°C
2. 使用一次性移液移液器轻轻地将解决方案转移到外植体上，如下所示。
  1. 取出培养基并加入2ml温热的PFA。在室温下孵育1小时。
  2. 去除PFA，并用含有DAPI的PBS洗涤外植体（参见配方6）。
  3. 将外植体在2ml封闭缓冲液（见方案7）中孵育30分钟。
  4. 去除封闭缓冲液，并在4℃下在2ml一抗溶液（见方案8）中孵育过夜。
  5. 第二天用PBS轻轻洗涤外植体三次。
  6. 在4℃下将外植体孵育2毫升荧光二抗（参见食谱9）48小时。
  7. 用PBS轻轻洗涤外植体三次。
3. 轻轻取出孔中的封闭缓冲液。

数据分析

外显成像与分析
1. 以4倍放大倍数的倒置荧光显微镜照片外植体
2. 将神经母细胞迁移从RMS外植体分为3组，如下：
  
  1
  只能引起紧凑型链条的外展
  
  2
  展示混合细胞生长（个体和链）的外植体
  
  3
  仅显示单独迁移的细胞的外显子
3. 如下（图2A-2E），使用半定量尺度对链和细胞生长的程度进行分级：（a）
  
  0 =不成长
  
  1 =小于10个链/细胞
  
  2 =大约10-50个链/细胞
  
  3 =大约50-100条链/细胞
  
  4 =广泛的增长（大于100个链/细胞）
  
  图2.使用半定量量表从外植体分级链/细胞生长从0-4。 A.零（0）表示无生长;一个代表小于10个链/细胞;两个代表〜10-50个链/细胞; D.三代〜50-100条链/细胞;四代表广泛的成长> 100条链/细胞。 F-学家通过从总生长区域减去外植体面积计算出生长面积，并且通过外植体中心使用线描工具确定最长的迁移长度。酒吧代表0.2毫米。
4. 对于每个外植体，使用Axiovision软件v4.1（Zeiss，Thornwood，NY）或类似的图像分析软件（图2F-2J）测量迁移面积和最长的迁移长度。由于外植体大小不尽相同，所以通过从外生长的总面积减去外植体的面积来测量每个外植体的面积（图2H），然后通过将外植体的面积表示为生长区：外植体。
5. 也可以通过使用如上所述的线绘图工具（Cregg等人，2010）来测量最长的迁移长度。首先，外植体中心必须识别（黄色条;图2G），然后将一系列条绘制在与外植体震中相交的整个生长区域（蓝条;图2I）。从震中到长周长的最长线代表最长的移动长度（图2J）
6. 平均所有结果跨不同的外植体治疗，然后平均结果跨个别实验，和图表平均值±SEM。使用GraphPad Prism（v4.03）评估方差均匀性的数据。如果发现正常分布，使用单因素方差分析来分析数据，与Bonferroni事后检测进行单独比较。在 P 0.05。
7. 对每个治疗条件至少10-12个外植体进行分析，并重复实验至少3次以创建重复。
注意：虽然离开外植体的成神经细胞可能有不同程度的迁移，但作者包括分析中的所有外植体。两个例外是，如果外植体以某种角度坐在Matrigel中，因此不能正确成像，和/或如果外植体没有完全浸没在Matrigel中，部分组织漂浮在培养基中。

食谱

80％乙醇溶液
80毫升纯乙醇
20ml H 2 O O
完成神经支气管介质
50毫升神经巴氏培养基
1 ml B27（50x）
1ml谷氨酰胺（4mM）
500μl青霉素/链霉素（10,000 U/ml）
0.5μlbFGF（1 mg/ml）
0.5μlEGF（1 ng/ml）
过滤介质使用无菌真空过滤器单元并存储在瓶子中，或在50ml组织培养无菌锥形管中
完整Matrigel
3 ml生长因子降低Matrigel
1毫升完整的神经巴氏培养基提前，将Matrigel储存溶液在4℃下溶解过夜，并使用冷移液管吸头和冷的Eppendorf管制备0.5ml等分试样，然后储存在-20°C。在外植体测定当天，在冰上解冻各个管，并在完整的神经巴氏培养基中稀释
0.1M磷酸缓冲盐水（PBS）
16mM Na 2 HPO 4
4mM Na 2 HPO 4 H 2 O 2// 150 mM NaCl
调整至pH 7.4
4％多聚甲醛（PFA）
4克多聚甲醛
用PBS
达到100ml 加热至最高60°C
加入几滴NaOH直至溶液变清净调整至pH 7.4
含有DAPI的PBS
10ml PBS
1μlDAPI
阻塞缓冲区
5毫升驴血清（5％，v/v）
0.5ml Triton X-100（0.5％，v/v）
用PBS
达到100ml
初级抗体
2μl山羊抗双皮质素（DCX）抗体
1 ml阻塞缓冲液
二次抗体
2μlCy3缀合的驴抗山羊
1 ml PBS

致谢

研究由NIH/NINDS（DJL：NS049545和NS30291）和NH& MRC研究金（AMT：628344）支持。这项工作改编自Dixon等人。（2016）。

参考

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