材料和试剂

96孔未处理的板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：260836）}
组织纸（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：75512）
高压灭菌的1.5ml Eppendorf管（Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：05-408-129）
50ml管（Corning，Falcon ^®，目录号：352070）
1 ml移液管吸头（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：2179-05-HR）
细胞过滤器，40μm（Corning，目录号：431750）
60毫米培养皿（康宁，目录号：430166）
杯式过滤器，50μm（BD，BD Biosciences，目录号：340630）
1 ml注射器，配有29½寸针头（Terumo Medical，目录号：BS-N1H2913）
FACS管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352058）}
小鼠：用于定时怀孕的适当实验基因型的男性和女性
适当实验基因型的受体小鼠
支持骨髓细胞的适当实验基因型的一只小鼠
注意：本协议是使用C57BL/6小鼠进行了优化的。对于6只幼仔的小狗，显示了动物使用的一个例子（图2）。如果需要，可以使用同源小鼠品系将供体来源的细胞与载体和受体来源的细胞区分开来。然而，这不是必需的，因为可以基于慢病毒GFP表达来区分条形码供体细胞。
可选：我们建议从3只幼仔中收集含有HSPCs的每个生物复制品的2个接收者（见图2），参见讨论（注）。
病毒：含有条形码文库的浓缩慢病毒上清液
Retronectin（Takara Bio，Clontech，目录号：T100A）
无菌PBS（GE Healthcare，目录号：SH30028.02）
抗体
Ter119生物素（Biolegend，目录号：116204）
Ter119 PE-Cy5（Biolegend，目录号：116210）
CD3 PE-Cy5（Biolegend，目录号：100310）
Gr1 PE-Cy5（Biolegend，目录号：108410）
B220 PE-Cy5（Biolegend，目录号：103210）
Sca1 PE-Cy7（Biolegend，目录号：108114）
c-kit APC（Biolegend，目录号：105812）
StemSpan ^TM SFEM（SFEM）（STEMCELL Technologies，目录号：09650）
青霉素/链霉素（P/S）溶液（Nordic Biolabs，目录号：SV30010）
细胞因子
SCF（PreproTech，目录号：250-03）
FLT3（PreproTech，目录号：300-19）
IL3（PreproTech，目录号：213-13）
IL6（PreproTech，目录号：216-16）
IL7（PreproTech，目录号：217-17）
台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T6146）
抗生物素MicroBeads（Miltenyi Biotec，目录号：130-090-485）
7AAD（Sigma-Aldrich，目录号：A9400）
Iscove的MDM中的10％牛血清白蛋白（BSA）（STEMCELL Technologies，目录号：09300）
环丙沙星，250mg /片（Teva Pharmaceutical Industries，目录号：011640）
Agencourt AMPure XP珠（Beckman Coulter，目录号：A63880）
Qubit dsDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32854）
高保真度Taq 聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11304011）}
高灵敏度DNA生物分析仪（Agilent Technologies，目录号：5067-4626）
BSA≥98％（Sigma-Aldrich，目录号：A9647）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
不含MgCl 2的HBSS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14175053）}
氯化钠（NaCl）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：74255）
蛋白酶K
染色缓冲液（见配方）
裂解缓冲液（见配方）

设备

解剖工具：精细镊子和剪刀用于FL解剖
杵和砂浆
移液器
离心机，温度控制（50和15 ml管）（Sigma Laborzentrifugen，型号：3-18K，目录号：10290）
离心机温度控制（用于Eppendorf管）（Beckman Coulter，型号：Microfuge 20R离心机，目录号：B31607）
MACS列（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
MACS分离器磁体（Miltenyi Biotec，型号：QuadroMACS ^{TM分离器，目录号：130-090-976）}
小动物热灯
细胞培养室和设备认证为慢病毒工作
Agilent 2100生物分析仪仪器（Agilent Technologies，型号：2100 Bioanalyzer Instrument）
Qubit荧光计
DynaMag 96孔板磁体（Thermo Fisher Scientific，目录号：12331D）
BD FACS Aria III（BD，型号：FACS Aria III）或类似的分选机
使用MiSeq Reagent Kit v3 150循环或Ion PGM系统[Thermo Fisher Scientific，型号：Ion PGM系统]的深度测序设备和试剂（例如，Illumina MiSeq系统[Illumina，型号：MiSeq系统] ]与Ion 314芯片组v2）

程序

慢病毒条形码库
之前已经检查过条形码图书馆的生成（Bystrykh等人，2014）。条形码在病毒库中的复杂性和分布影响了使用相同条形码标记两个细胞的风险，因此对可以忠实追踪的单细胞命运数量构成了限制。因此，这些性质需要根据每个新的条形码库和病毒准备（Lu et al。，2011; Naik等人，2014年; Bystrykh和Belderbos， 2016）。根据经验，每个接收者追踪的细胞数不应超过图书馆多样性的10％（Naik等人，2014）。此外，在实验之前，需要使用感兴趣的供体细胞类型对病毒库进行滴定，因为转导效率可以从细胞类型到细胞类型变化很大。在我们最近的研究中，使用了先前描述的条形码库（Lu等人，2011）。
定时怀孕设置
一天-14
1. 下午，将两只雌性小鼠加入每只含有一只雄鼠的笼子（图2）
2. 第二天早晨，女性与男性分离，检查阴道栓塞。
  注意：在这个时间点检测阴道塞计数为0.5 d.p.c.阴道塞的存在不是怀孕女性的保证。同样地，缺少阴道塞并不意味着女性没有怀孕。为了增加受精的机会，应建立一个以上定期怀孕的笼子。 E12女性可以触诊腹部膨胀，双侧鼓胀和体重增加以确认怀孕。然而，如果女性怀孕的胚胎数量很少，可能难以区分。

转导和细胞分选制剂
第0天

转导制剂
1. 用无菌PBS稀释Retronectin至40μg/ml。
2. 通过将100μl稀释的Retronectin从步骤C1a加入到非培养处理的96孔板中，每个生物复制物涂一个孔。
  注意：如果需要多于一个生物复制物，可以将6只胚胎的胚胎分成2个相等的生物重复，以在2个单独的孔中转导（图2）。
  可选：每个生物复制体的转导的LSK可以稍后分为两个相等的部分，并移植到两个收件人中以便于数据解释（见注释）（图2）。
3. 涂一个另外一个井，以进行转移控制。
4. 将板在4℃下过夜。
  
  图2.基于估计的幼崽数量和细胞产量的实验动物使用实例
工具
高压灭菌工具，杵和砂浆，薄纸，Eppendorf管。

细胞分选和培养制剂
可选：可以在第1天执行以下步骤。

准备用于FACS的LSK抗体混合物（在暗处存储4℃，直到使用）注意：

这里列出的荧光染料是建议，可以用其他颜色代替。
谱系抗体包括：CD3 PE-Cy5，Gr1 PE-Cy5，Ter119PE-Cy5，B220PE-Cy5。//em>

抗体	荧光染料	稀释	最终集中（μg/100μl）
c-Kit	APC	1：200	0.1
Sca1	PE-Cy7	1：200	0.1
谱系抗体	PE-Cy5	1：400每个	0.05每个

为单一染色剂和适当的染色对照制备抗体稀释液
在含有1％P/S的SFEM中制备细胞因子混合物（在4℃下储存直至使用）

细胞因子
终浓度（ng/ml）

SCF
50

IL6
50

FLT3
50

IL3
10

IL7
10

细胞分选和转导
注意：所有解剖应在适当的实验室进行，并在无菌生物安全柜中进行细胞制备。
第1天
1. 收获总BM支持细胞
2. 收获14.5 d.p. FL供体细胞
  1. 在早晨安乐死怀孕的女性（例如，，颈椎脱位或CO <2>窒息）。
  2. 将皮肤提起腹膜，并用剪刀做一个小切口。
  3. 拔出子宫角并切开子宫释放子宫。
  4. 在装有5ml冷（4℃）染色缓冲液的60mm培养皿中从子宫膜解剖胚胎。
  5. 将胚胎放置在高压消毒的薄纸上，并使用精细的镊子隔离FL。
  6. 将FL转移到一个新的60毫米培养皿，1毫升，每个FL的冷染色缓冲液，并重复所有的胚胎，仅将同一生物复制品的FL组合成相同的培养皿。
  7. 通过轻轻移液使用1 ml移液管吸头解离之前，取出任何附着的结缔组织和肠
  8. 通过50μm杯过滤器过滤所得的单细胞悬浮液，并重复进行生物学重复
  9. 计数细胞，并在4℃以350×g离心细胞5分钟。
    注意：预期大约40 x 10 ⁶/FL包括红细胞，尽管可以预期细胞数量的一些变化（取决于解剖期间细胞的损失和胚胎的大小）。 ;
  10. 去除上清液并准备Ter119消耗。
3. Ter119耗尽使用MACS
  Ter119由成熟的红细胞和红细胞祖细胞表达，它是E14.5 FL中最丰富的细胞。这些细胞的消耗丰富了LSK群体，缩短了排序时间。
4. 细胞染色和分选
  以下简要描述我们使用BD FACS Aria IIu或III的工作流程。
  1. 将细胞沉淀物重悬于LSK抗体混合物（步骤C3a）中，体积为100μl/10μg/孔的Ter119耗尽细胞。
  2. 将样品和适当的染色对照在4℃下在黑暗中染色30分钟
  3. 对于每个样品，准备一个含有100μl冷染色缓冲液的Eppendorf管，用于后排序纯度检查，一个含有500μlSFEM以收集分选的细胞。
  4. 用染色缓冲液冲洗染色的细胞，在4℃下以350×g离心5分钟，除去上清液。
  5. 将样品重悬于含有7AAD的染色缓冲液中，终浓度为1μg/ml 7AAD。
    注意：重新悬浮细胞进行排序的缓冲液体积取决于细胞数量和排序设置（例如，当在BD FACS Aria III上分选时，可将7×10 6细胞重新悬浮在700μl中大约4,000事件/秒，流速<4，纯度掩模0-32-0，使用70μm喷嘴）。
  6. 使用单染色控制设置染色补偿矩阵
  7. 设置LSK门，如图3所示
    
    图3.细胞分选期间LSK HSPC门控的FACS图。 Sca1和c-Kit的荧光减少一个（FMO）对照显示了我们绘制的严格门控，以最大化排序纯度（再分析图）。 FL LSK门口的预期HSC内容在我们的经验中从4-10％不等。
  8. 采取适当的预防措施，确保分选纯度> 95％。
  9. 将所有样品的LSK细胞分选成含有500μl冷SFEM的收集管。
    注意：为每个计划的收件人排序至少11,000个LSK，以补偿步骤E9-E10中的细胞损失。如果需要技术重复，可以从2个收件人处获得3 FLF的足够的LSK（见注释）。
  10. 记录来自排序和储存管的细胞数量。
5. 转导
  该步骤应在适用于慢病毒转导的程序的适当的细胞培养罩中进行。
  注意：来自胎肝和成骨骨髓的HSPC在转导效率上差异很小，在胎儿HSPCs中达到相同的转导效率所需的病毒较少。在启动协议之前，您的慢病毒条形码库专门针对所选择的群体进行滴定，确定实现转导效率所需的病毒数量，以确保每个接受者的转导细胞数量不超过慢病毒条形码库复杂度的10％。对于80K的估计条形码复杂度（Lu等人，2011），我们的目标是转导效率为15-30％，意味着每个受体小鼠注射的10K细胞中的1,500-3,000个细胞被条形码化（图4）。这常常产生了在每个接受者中追踪的数百个细胞命运，其中大约60个克隆显示了活性HSC的功能特征和相同条形码转导多于一个细胞的最小情况（Kristiansen等，2016）（参见附注）。/em>
  
  图4. FL LSK群体内的HSC频率（左）由LSK CD48 ^- CD150 ⁺定义的FL HSC的代表性FACS图。（右）在两个单独的实验中，从2升的6 + 3个别胚胎编制的LSK内的HSC的％频率。
6. 受体小鼠的照射
  1. 在剂量之间3小时，辐射2 x 450 cGy的接受者。移植应在第一次给药的24 h内进行注意：分裂剂量照射对小鼠更温和，同时仍然达到预期的致死性骨髓消除作用。接受者小鼠在照射之前不需要用抗生素治疗。
  2. 在饮用水中加入环丙沙星至终浓度为125 mg/L，持续14天。
静脉注射
LSK群体是多种含有茎和祖细胞，其在培养中存活和增殖不同。为了最大限度地减少细胞损失，我们省略了额外的细胞计数步骤，并将第2天的供体细胞数量与第1天的分选细胞数相当。
注意：以下步骤必须严格遵守慢病毒处理和批准的动物使用协议的生物安全协议。
第2天
1. 早上，从第1天到40μm细胞过滤器的过滤器支持细胞可能会在晚上发生显着的聚集。计数细胞。
  注意：细胞计数包括红细胞。
2. 在4℃下以350μg离心支持细胞5分钟，并重悬于冷的无菌PBS中至浓度为200K /100μl。
3. 在含有500μl冷PBS的高压灭菌的Eppendorf管中收集每个转导的LSK细胞样品注意：为了最小化与过滤相关的细胞损失，供体细胞直接从孔中收集用于移植。
4. 用至少2轮200μlPBS冲洗每个孔，以回收所有细胞，并在相应的Eppendorf管中结合。
  注意：使用显微镜检查所有细胞是否已从孔中采集。
5. 将每个样品的小体积转移到原始孔中，以在第3天转导效率读数。将细胞因子混合物添加至最终体积为150μl，并将细胞在37℃下孵育5％CO 2一夜之间
6. 向每个样品管中加入另外500μl冷PBS，并在4℃下以350 x g离心5分钟。
7. 根据适当的生物安全方案处理慢病毒上清液。
8. 加入200K支持细胞（100μl来自步骤E2）/10K分选和转导的FL LSK并加入1ml冷PBS。
9. 以350 x g离心样品5分钟，并根据适当的生物安全方案弃去上清液。
10. 将沉淀重悬于275μl冷PBS/11,000分选转导的FL LSK中（步骤D4i）。
11. 使用29磅1/2英寸1毫升的针头，将样品的250μL（相当于10000个分选和转导的LSK）注入每个受体的尾静脉。
  注意：我们通常在热灯下加热受体小鼠5分钟，以促进静脉注射。
转导效率读数
第3天
1. 收集在第2天放置的转导细胞，用于转导效率读数（步骤E5）和未转染的控制到各个FACS管中。
2. 在4℃下以350×g离心样品5分钟，除去上清液
3. 将每个样品重悬于含有7AAD的150μl染色缓冲液中
4. 通过FACS分析活体（7AAD ^-）细胞之间的GFP ⁺事件百分比（图5）。
  
  图5显示了在第3天时GFP转导效率读数的实施例。显示了来自未转导对照（左）和转导样品（右）的7AAD-单链LSK细胞。
外周血分析
移植后4-8周
我们建议检查外周血中GFP ⁺条形码细胞的初始植入。这是通过受体小鼠的尾静脉出血进行的，并且使用FACS评估粒细胞和B细胞之间的GFP ⁺细胞百分比。
注意：与FL HSPCs在第3天的转导效率读数相比，我们经常观察到外周血中的GFP％较高。这可能是由于优先转运高度增殖的HSPC，其更好地植入
条码抽取
长期HSCs的克隆动力学在移植后约12周后稳定（Verovskaya等人，2013）。因此，我们建议在移植后16周内阅读条形码分发。
移植后16-20周
1. 细胞分选和裂解
  1. 基于提出的具体问题的感兴趣的细胞群体是FACS分类的。如步骤D4所述，将细胞分类到不粘管中的500μl染色缓冲液中，并且可以最初以-80℃作为细胞沉淀储存。
    注意：粒细胞几周的周转时间短，因此是近期HSC活动的良好表现。另一方面，淋巴细胞可以存活数周甚至数月，因此在条形码标签时将含有来源于长期和短期祖细胞的条形码。
  2. 准备细胞裂解缓冲液（参见食谱）。
  3. 将细胞沉淀物在100μl细胞裂解缓冲液/样品（在56℃下2小时，95℃下10分钟灭活蛋白酶K）的基因组DNA中裂解，并在随后的-20℃保存。
    注意：使用较少数量的细胞时，建议直接将其分解为裂解缓冲液以立即溶解。细胞数量是获得群体良好测序覆盖率的限制因素
2. 图书馆准备和条码深度测序
  1. 根据制造商的建议，使用Ampure XP珠纯化基因组DNA。
  2. 使用高灵敏度方法（例如，Qubit荧光计和Qubit dsDNA HS测定试剂盒）测量基因组DNA浓度。
  3. 使用适当的引物和高保真DNA Taq 聚合酶（例如）将来自每个样品的多达100ng DNA平均分配到两个技术重复PCR反应（每个50ng）中。，Q5 DNA聚合酶，NEB）扩增条形码片段（图1）。根据制造商的建议，使用Ampure XP珠纯化扩增的片段。
    可选：根据PCR引物的设计和测序平台的选择，可以进行PCR扩增的第二步，以添加多重适配器。
  4. 使用Bioanalyzer HS DNA分析试剂盒并根据制造商的说明书对Amplions进行定量。正确大小的产品，不污染引物二聚体对成功测序至关重要。根据制造商的建议，可以用另一轮Ampure XP珠粒纯化除去引物二聚体的存在。
  5. 用于测序的池等效量的扩增和索引条形码库 - 所需的产品浓度取决于所选择的测序平台。
    注意：多路复用的程度应该通过选择的测序平台的读取容量和您的条形码单元的预期复杂度来通知。
  6. 经验丰富的技术人员根据制造商的说明进行排序。
    注意：我们迄今为止使用Illumina MiSeq系统（MiSeq Reagent Kit v3 150周期，Illumina）和Ion PGM（Ion 314 Chip Kit v2，Thermo Scientific）平台取得了很好的成功。

数据分析

细胞条形码分析的初始步骤旨在为每个排序样本生成可靠条形码列表，并与条形码读取频率相结合，反映群体内每个克隆的丰度。该分析中最重要的部分是过滤出由引入的条形码，例如，排序错误，否则会偏离结果。过滤步骤是为选择条件库和实验设计定制的。例如，如果选择的条形码库存在参考库，则可将顺序条形码映射回参考，并且过滤步骤可以被简化。在这里，我们简要提供一个例子，分析随机生成的缺少已知参考文献的条形码库（图1; Kristiansen等人，2016）。对于深入的建议，我们提供了一些相关的参考。

通过使用定制R脚本和R包ShortReads来识别侧翼序列来隔离条形码。
通过使每个条形码列表例如，Starcode算法（Zorita等人，2015）来纠正排序错误。基于Levenshtein距离，识别和删除由排序错误产生的子条形码，同时读取频率与父条形码的合并。
基于所检索的总读取次数和采样的单元数量，针对每个排序的总体单独定义低频条形码的截止值，使得低于单个单元的预期读取表示的条形码被排除在进一步分析之外。
评估从每个群体的两个技术性PCR重复获得的条形码列表中的读取频率与标准的相关性。如前所述（Naik等人，2014）。只有通过技术重复的所有过滤标准的条形码才能进一步分析。
注意：这些严格的过滤条件为下游分析产生了保守的条形码列表。然而，重要的是要注意，这些过滤步骤可以排除非常低的表示的真实条形码（Naik等人，2014）（图1）。
可以使用自定义脚本进一步分析条形码列表的重叠，读取频率分布。

笔记

对于不同谱系的细胞的亲缘关系分析，定性条码重叠是关键读数。为了避免错误的正条形码重叠读出，特别重要的是控制相同的条形码不会进入多个单元格。这可以通过比较接收在同一孔中转导的LSK细胞的两个技术重复接收者（图2）的过滤条形码列表来完成（Naik等人，2014）。由于短病毒孵化时间不太可能允许HSC分裂事件，所以两个接收者之间的任何重叠可以被认为是噪声。目前的协议被设计为通过简单地分选（步骤D4i）并且每个每个Retronectin包被的孔的数量的两倍来容纳每个生物复制物（图2）来容纳两个技术重复接收者。在选择条形码读取的人群时，我们还建议将两个预期条形码重叠的人群作为阳性对照。这些控制将允许正确验证您的实验设置中的信号与噪声比（Kristiansen等人，2016）。
如果实验设置正确，并且应用了适当的控制和条形码滤波步骤，则各个实验之间的重复性应该很高。然而，不同年龄的供体HSPCs在转化的倾向上有很大差异，并将产生年龄特异性条形码分布。

食谱

染色缓冲液
0.5％BSA
注意：使用BSA≥98％。
2 mM EDTA
在没有MgCl 2的HBSS中，
裂解缓冲液
0.1M Tris-HCl pH 8.5
0.5 mM EDTA pH 8
0.2 M NaCl
0.2％SDS
0.1 mg/ml蛋白酶K
注意：使用前立即加入裂解缓冲液。

致谢

该协议最初在Kristiansen等人描述和改编。（2016）。这项工作得到瑞典癌症基金会，瑞典研究委员会，StemTherapy以及The Knut和Alice Wallenberg基金会的资助。

参考文献

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