材料和试剂

细胞培养瓶，面积150cm 2（Corning，目录号：430823）
15 ml Falcon管（Greiner Bio One International，目录号：188261）
Micropipette P200提示（Corning，目录号：4823）
24孔板平底（Corning，Costar ^®，目录号：3527）
70μm细胞过滤器（Corning，Falcon ^{®，目录号：352350）}
15ml聚苯乙烯血清移液管（Corning，Falcon ^{®，目录号：357551）}
如从Perego等人所述获得黑素球，从获自黑素瘤手术标本的细胞悬浮液或从干细胞培养基（SCM）培养后的先前建立的黑素瘤细胞系开始（Perego等人，，2010）
RPMI
10％FBS
台盼蓝溶液，0.4％（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
SCM（见配方）

DMEM：F-12,1:1混合物（Lonza，目录号：BE12-719F）
表皮生长因子（EGF）（PeproTech，目录号：AF-100-15）
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（PeproTech，目录号：100-18B）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I6634）
二盐酸腐胺（Sigma-Aldrich，目录号：P5780）
亚硒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9133）
孕激素（Sigma-Aldrich，目录号：P6149）
转铁蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：T8158）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S8761）
1x磷酸缓冲盐水（PBS）（Lonza，目录号：17-516）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A1933）
HEPES缓冲区（Lonza，目录号：BE17-737）
L-谷氨酰胺（Lonza，目录号：BE17-605E）
青霉素 - 链霉素（Lonza，目录号：17-602E）

设备

自动移液器（PBI，目录号：857075）
具有CO 2输入的组织培养培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Forma ^{TM系列II 3110）}}
离心机（Eppendorf，目录号：5810）
血细胞计数器（Marienfeld-Superior，Bürker，目录号：0640211）
光学显微镜（Carl Zeiss，型号：Axiovert 25）

程序

注意：

用无菌工具和设备在组织培养罩中工作。
该过程针对黑素瘤细胞进行了优化。一般原则可以适用于其他组织的癌症干细胞，优化。

准备干细胞培养基（SCM）并将其在黑暗中保存在4°C。 SCM应在3-4周内使用。还可以制备所有补充剂（DMEM：F-12,1:1混合物，补充上述在材料和试剂部分中的组分从6b至6o）的浓缩溶液（10x）。浓缩的培养基可以在20℃下储存3个月。生长因子（b-FGF和EGF）必须直接添加到培养基中注意：如果您打算用不作为黑色球体培养的细胞建立球形形成测定（SFA）（粘附的黑素瘤细胞在RPMI + 10％FBS中生长，则从黑素瘤后处理获得新鲜的黑素瘤组织悬浮液手术标本），从本程序的第10步开始。在用血清培养的细胞的情况下，在SCM中电镀前，确保除去所有血清（大量洗涤细胞）。
从15 ml Falcon管中的培养瓶中收集黑色球。
在室温（RT）下以30×g离心10分钟。
丢弃上清液。
通过使用微量移液管P200尖端在100-200μlSCM中上下移动约80-100次来分离沉淀物。
注意：为了分离沉淀物，将尖端放置在管的底部，并将吸管快速上下移动，以便悬浮颗粒和细胞而不会发生气泡（太平缓的移液将导致未完全的球体解离）。在我们手中，机械解离是获得单细胞悬浮液的细胞活力和结果再现性方面最好的方法。
将解离的黑色球悬浮于2ml SCM中
在室温（RT）下以150×g离心10分钟，弃去上清液。
通过使用微量移液管P200尖端上下移动约80-100次来分离沉淀。
在SCM中悬浮解离的黑色球体并计数。
注意：确保获得单细胞悬浮液。如果簇仍然存在，请重复步骤6-9。最终细胞悬浮液可以通过70μm的细胞过滤器进一步过滤。
取所需数量的活细胞（使用血细胞计数器计数，在台盼蓝溶液0.4％存在以排除死细胞后测定），并在SCM中调整至100细胞/100μl的终浓度。
在每个24孔板中移取400μl/孔的SCM，每个细胞系或治疗总共6个孔。
注意：在我们手中，SFA主要用于测试细胞因子和趋化因子对黑素瘤干细胞自我更新的影响（Tuccitto et al。，2016）。我们认为可以优化黑素瘤SFA以测试药物（靶向干细胞标志物或活性信号通路）或生长因子对黑素瘤干细胞自我更新和/或活力的影响。
在每个孔中种子100微升的SCM细胞（100个细胞/孔），每个条件至少准备4-6个重复。种子细胞应显示为单数（见图1A）。

图1.黑色素瘤球形成。 A.单细胞黑色球体接种在SCM中;当细胞开始分裂时出现双峰; C.细胞增殖过程中形成的三倍体; D.完全形成的黑色球。总倍率200倍（A-D），比例尺= 20微米
将板置于37℃的培养箱中，5％CO 2
接种后24-72小时，细胞双峰，三联体将出现在孔中，并可在光学显微镜下计数（参见图1B和1C）。
注意：如果介质变黄，请将新鲜介质添加到孔中，而不会分离或接触正在进行的成型球体。
播种后5-8天，每孔中将会完全形成黑色球体，并且可以在光学显微镜下再次计数10倍物镜（总放大100倍），分析整个孔。如果球体足够大以与单层聚集体和单个细胞清楚区分，还应使用较低的放大倍率（总放大倍数为20-50倍）。为了获得更好的效果，当它们清晰可见并且不让它们过度增殖时，计数黑色球体。如果发生这种情况，黑色球体可能附着在板上，可靠的计数将是困难的。
注意：当黑斑形成时（见图1D），由于其紧凑的3D结构，难以区分细胞的确切数量。偶尔，可以观察到约10-30个细胞的一些单层聚集体，但是这些聚集体不应被视为黑色球体（图2）。一般来说，球蛋白可以在第5天到第10天从SFA播种计数，应该为每个细胞系或样品确定最佳计数时间，然后在不同的实验中保持恒定。为了简化球体的计数，可以用一个标记来绘制一些线，将井细分为四分之一。

图2.非黑洞群集可以在SFA中找到的非球形簇的示例。这些群集不能算作球体。总倍率200倍，比例尺= 20微米。

数据分析

球形效率可以报告为除以原始接种细胞数的球体百分数（％），或考虑到单株细胞总数计算的球数。我们通常将结果呈现为生物重复的平均值±SD（或SEM）。每个细胞系被多次测试以确保在广泛细胞培养后保持球形成效率。

笔记

自我更新效率是细胞型或细胞依赖性，取决于黑色球起源。在我们手中，黑色球显示球形成效率的30％至15％（Perego等人，2010; Tuccitto等人，2016）。
对于维持在黑色球体的培养物中的细胞，与先前在具有血清（粘附黑素瘤培养物）的常规黑素瘤培养基中培养的细胞相比，自我更新效率通常更高。与粘附培养相比，黑色球培养物已经富集CSC，因此粘附细胞系的SFA通常会导致较低的球体形成效率。

食谱

干细胞培养基（SCM）（500毫升）
DMEM：F-12 1：1混合物 10μg/ml EGF
5μg/ml bFGF
600μg/ml D-葡萄糖
5μg/ml胰岛素 1μg/ml腐胺二盐酸盐 0.01微克/毫升亚硒酸钠
0.01μg/ml孕酮
20μg/ml转铁蛋白
0.11μg/ml NaHCO 3
4毫克/毫升BSA
119.2μg/ml HEPES缓冲液
292μg/ml L-谷氨酰胺
200 UI/ml青霉素 - 链霉素
注意：

1×PBS中的10x BSA溶液可以储存在-20°C。
如果采用储备溶液，请确保最终体积达到500毫升，否则一些组分将被稀释，介质不能起作用。

致谢

该协议在2010年的Perego等人，2010年和Tuccitto等人，2016中使用。这些作品得到了意大利Ricerca sul Cancro（CC IG-10615）的支持，。

参考文献

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