材料和试剂

水稻（Oryza sativa）品种日本晴
注意：水稻（O. sativa）栽培品种Nipponbare植物在室温（25-32℃）下在28℃，光照14小时/10小时的光周期下生长。来自4周龄植物的成熟叶子用于气体交换测量。

设备

便携式气体交换系统，Li-6400XT（Licor，USA），带标准室
Licor气体交换系统，特别是Li-6400和Li-6400XT，广泛用于光合作用和气孔导度测量。标准室作为Li-6400XT的基本配件，采用高精度温度传感器和内部光传感器组装（见图1）。因为气孔导度是叶片温度的函数（von Caemmerer and Farquhar，1981），对叶片温度的精确控制是重要的。此外，为了诱导特定的气孔蓝光响应，需要内部光传感器来测量额外的红光和蓝光（对于光源见下文）。因此，具有高精度温度传感器和内部光传感器的标准室适用于本实验
光源
光源通过带有卤素投影灯（15 V/150 W;荷兰飞利浦）的光纤照明器提供，作为光源。电源（MORITEX，目录号：MHAB-150W-100V）用于为灯供电。用滤光片（＃2-61和＃5-60，Corning，USA）获得红光（660nm）和蓝光（470nm）。

程序

在气体交换测量之前，将植物在黑暗中保持过夜。过夜黑暗治疗持续至少14小时，以确保气孔完全闭合。
注意：在我们的例子中，我们将工厂保持在与气体交换系统相同的实验室内的黑暗中。
按照正式使用说明书 https://www.licor.com/env/support/resources?p=6400XT 。

设置固定流量模型的控制，为500μmolsec ^-1。
重要提示：对于标准室，流量低于500μmol/sec的气流将导致气体循环不足，特别是当叶面积小于室面积（6 cm ²）。

调整干燥剂以保持参考相对湿度（RH_R）约为65％。
注意：在我们的情况下，低于60％的相对湿度将导致气孔导度不稳定（低湿度胁迫）。

使用CO 2混合器将环境CO 2浓度（400μmolmol -1，以上）设定参考CO 2 。

将叶温度设置在室温。
注意：在我们的例子中，我们将叶子温度设置在24°C。
重要提示：不要将"块温度"（室温度）设置为常数而不是"叶温度"，因为即使"块温度"稳定，叶片温度仍会波动。根据气孔导度方程式（参见Li-6400XT官方使用手册），叶片温度是计算气孔导度的关键因素之一。稳定的叶片温度使得气孔导度值代表气孔蒸腾。

在这些参数变得稳定后，按照官方说明书中的说明与系统相符合，然后将米片夹在室中心（图1B）。所有的参数都已经稳定后，再次匹配系统。
注意：确保叶子的下侧接触温度传感器（见图1）。

图1.如何夹住室内的稻叶和照明系统的图像。 A.标准室的图片。箭头表示温度传感器和内部光传感器的位置。 B.将米叶夹在室中心的图片。确保叶面接触温度传感器。 C.和D.红色和红色+蓝光照明系统的图像。

打开一个日志文件，将其命名，并添加一些必要的注释，例如执行测量的研究人员的名称。然后，打开自动程序（见图2），设置测井频率（Log every_ _ secs），持续时间（_ _ _分钟运行）和匹配频率（每_ _ _分钟匹配）。
注意：在我们的例子中，我们设置这些参数，如图2所示（右图）。

图2.自动程序的参数。 A.自动程序中内容的图片。高亮度选项"AutoLog"是此测量中使用的程序。 B.输入"AutoLog"程序时参数设置的图片。

注意：步骤9和10中的数据由Auto Program记录。

首先在黑暗条件下测量30分钟的气孔导度，然后从室顶部以700μmol/m 2以上的红光照亮叶子，直到气孔导度和光合速率达到稳定状态（稳定至少10分钟）。
注意：在我们的例子中，总是需要超过120分钟才能达到稳定状态。
在红光背景下，加入弱蓝光（3μmolm〜sup sec ^-1）30分钟，然后关闭蓝灯，保持叶亮在红灯下还有90分钟以上。对于红光和红+蓝光照明的图像，请参见图1C和1D
关闭自动程序和数据日志文件。
打开房间并测量叶子的宽度。因为室的长度是3厘米，叶片的面积等于叶宽x 3厘米
将数据从设备传输到计算机。
用Excel（Microsoft，USA）打开数据文件（.xls）。将6厘米²的默认叶面积更改为步骤12确定的实际叶面积（数据文件如图3所示）。数据表将自动重新计算新叶面积的气孔导度等参数。

图3. Excel中的数据示例：更改Excel文件中叶面积的数据。突出显示的列"区域"显示默认叶面积（6厘米²）应该在步骤12之后更改为实际的叶面积。

数据分析

气孔导度由仪器软件自动计算。选择"Obs"列（指本实验中记录的对象数）和"Cond"列（指气孔导度），使用"图表"工具制作散点图（x，y）图（图4）。由于物体每分钟记录一次，图表反映了气孔导度变化的时间过程。

图4.气孔导度的数据分析。选择突出显示的列"Obs"和"Cond"作出分散（x，y）图。红色箭头和蓝色箭头显示光源打开和关闭时的点数。

笔记

便携式气体交换系统Li-6400XT不是简单的仪器。想要使用该系统进行实验的研究人员应该首先从Licor公司（或销售代理）进行基本培训。基本操作包括预热，校准和匹配系统等。被纳入基础训练。因此，在本协议中，我们省略了程序中这些部分的细节。
由于气孔对光敏感，因此所有气体交换实验应在暗光（小于3μmol的光子m ^-2 sec ^-1）室或黑暗的房间。
该方案也适用于其他植物物种，单子叶植物和双子叶植物，如玉米，拟南芥等。对于具有不规则形状叶子的植物（例如，，拟南芥），我们建议使用扫描仪或专业仪器，如LI-3100C面积计（Licor，USA）来计算叶面积准确。

致谢

该协议改编自Toda等人。（2016）。这项工作部分由日本教育，文化，体育，科技部科学研究资助单位（15H05956至TK）和日本科技厅[先进低碳技术研究开发计划]。

参考文献

Toda，Y.，Wang，Y.，Takahashi，A.，Kawai，Y.，Tada，Y.，Yamaji，N.，Feng Ma，J.，Ashikari，M.and Kinoshita，T。（2016） ; Oryza sativa H ⁺ -ATPase（OSA）参与水稻哑铃状保卫细胞的调节。植物细胞生理学57（6）：1220-1230。 >

von Caemmerer，SV和Farquhar，GD（1981）。一些关系在光合作用的生物化学和叶片的气体交换之间。植物 153（4）：376-387。