材料和试剂

pH测试条（VWR，BDH ^{®，目录号：BDH35309.606）}
亲水性聚丙烯膜过滤器，直径47mm，孔径0.45μm（Pall，目录号：66548）
Fisherbrand ^TM B类透明玻璃螺纹小瓶，带有封闭件，3.7 ml（Fisher Scientific，目录号：03-338A）
滑动注射器1毫升（BD，目录号：309659）
PTFE膜过滤器，孔径0.2μm，直径6 mm（VWR，目录号：28145-491）
Whatman ^{TM滤光片，12.5厘米（Sigma-Aldrich，目录号：WHA1113125）}
锥形离心管，50ml（Corning，Falcon ^{®，目录号：352098）}
硅胶GF制备TLC板，预吸附剂区，20 x 20厘米，1,000微米（Analtech/iChromatography，目录号：P32013）
DMSO的菌丝体冷冻库存。 sc疮（Fyans等人，2015）
Bacto ^TM胰蛋白酶大豆肉汤培养基（BD，Bacto ^{TM，目录号：211825）}
氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：BP359-212）
氯仿，ACS级（VWR，BDH ^{®，目录号：BDH1109）}
盐酸（HCl），ACS级（Avantor 性能材料，目录号：638801）
无水硫酸钠（Na 2 SO 4），ACS级（Fisher Scientific，目录号：S421-500）
乙二醇（VWR，BDH ，目录号：BDH1125）
碳酸氢钾（KHCO 3），ACS级（Sigma-Aldrich，目录号：237205）
甲醇（MeOH），HPLC级（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
甲酸，试剂级（Sigma-Aldrich，目录号：F0507）
HiPerSolv CHROMANOR ^{®用于HPLC的乙腈（ACN）（VWR，BDH，目录号：BDH83639.400）}
大豆粉，脱脂（MP Biomedicals，目录号：960024）
D-甘露醇（AMRESCO，目录号：0122）
乙酸乙酯，ACS级（Sigma-Aldrich，目录号：319902）
2-丙醇，HPLC级（Fisher Scientific，目录号：A451SK-4）
乙酸，ACS级（Sigma-Aldrich，目录号：695092）
水，HPLC级（EMD Millipore，目录号：WX0008-1）
大豆面粉甘露醇肉汤（SFMB）培养基（见食谱）
制备型TLC流动相（参见食谱）

设备

玻璃锥形瓶，125ml（Corning，PYREX ^{，目录号：C4980125）}
玻璃锥形瓶4升（Corning，PYREX ^{，目录号：C49804L）}
玻璃过滤器支架组件，带漏斗，烧结基座，止动器和夹具，47 mm（EMD Millipore，目录号：XX1004700）
Nalgene ^TM具有密封闭合的PPCO离心机瓶，250ml（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：31410250）}
Sorval ^{TM ST16R台式冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Sorval ^{TM ST 16R，目录号：BCT25） br />}}}
Innova ^® 42R冷藏培养箱振荡器，轨道直径为1.9厘米（Eppendorf，New Brunswick ^{TM，型号：Innova ^® 42R，目录号：M1335- 004）}
2升塑料容器
Nalgene ^TM具有封闭的FEP FEP分液漏斗，2L（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：4301-2000） br />}
IKA ^®旋转蒸发器系统（IKA ^{®，型号：RV 10数字V）}
VWR ^®带可编程温度控制器的冷冻循环浴（VWR，型号：VWR ^®冷藏循环浴，目录号：89202-982）
KIMAX ^®具有PTFE活塞和玻璃塞的Squibb分液漏斗，125 ml（Kimble Chase Life Science and Research Products，目录号：29048F-125）
DryFast隔膜真空泵（Welch Vacuum - Gardner Denver，目录号：2044）
Biohit mLINE 单通道机械移液器，2-20μl（VWR，目录号：47745-545）
Aldrich矩阵TLC显影槽（Sigma-Aldrich，型号：Z126195）
紫外灯带便携式机柜（Analtech/iChromatography，目录号：A93-04）
金属铲子
Thermo Scientific ^{TM干式加热器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：88-860-021）}
ZORBAX StableBond80ÅC18半制备型HPLC柱，9.4 x 250 mm，5μm（Agilent Technologies，目录号：880975-202）
化学安全罩
KIMAX ^®分级过滤瓶，1L（Kimble Chase Life Science and Research Products，目录号：27060-1000）
GeneMate涡流混合器（VWR，目录号：490000-094）
Agilent 1260 Infinity分析级LC纯化系统，具有四元泵，自动进样器，二极管阵列检测器和馏分收集器（Agilent Technologies，型号：1260 Infinity）

程序

文化成长
1. 准备种子文化。通过将1ml DMSO冷冻储存物接种到125ml锥形瓶中的25ml胰蛋白酶大豆肉汤培养基中，并在28℃下振荡（200RPM）孵育48小时。
2. 将10ml的种子培养物在4升锥形瓶中1升SFMB培养基中培养10分钟，并在25℃下振荡（200RPM）孵育10天（参见注释1和2）。
3. 将培养物分成四个250ml离心瓶，并在4℃下以3,005×g离心15分钟以沉淀细胞材料。将上清液倒入2升塑料容器中，储存于-20°C直到需要。即使立即提取上清液，将其冻结至少24小时也是有用的（见注3）。
有机提取（见图2和附注4）

图2.从S提取冠醚酰基植物毒素期间执行的主要步骤的示意图。 sc疮培养上清
1. 使用pH条测量培养上清液的pH，并使用5N NaOH溶液（〜4-5ml）将pH调节至11-12。
2. 将上清液倒入2L分液漏斗中，并用0.5体积（〜450ml）氯仿萃取。要进行萃取，将氯仿加入分液漏斗中，关闭漏斗塞，并摇动漏斗以使内容物良好混合。打开旋塞以释放任何表达的气体，然后重复振荡，直到不再表达气体。允许有机（底部）和水（顶部）层通过重力（〜15-20分钟;图3A）尽可能分离，然后打开旋塞并收集有机层。如果存在乳剂层，则可以通过在4℃下以3,005×g离心10分钟收集并分离，并将水层返回到分液漏斗（图3B）。弃去有机层，并用另外0.5体积的新鲜氯仿重复提取含水上清液。进行提取总共三次，每次提取后丢弃有机层（见注5）
  
  图3.提取。 sc ies 用氯仿培养上清。 A.使用2L分液漏斗进行提取。混合上清液和氯仿后，通过重力使相分离尽可能多。上层深棕色层为水相，下层为有机相。 B.当存在乳剂层时，将其收集到离心瓶中，并通过离心分离各相。
3. 通过加入1N HCl（水溶液）（〜5ml）将水性上清液酸化至pH为1-2。
4. 将上清液倒入2L分液漏斗中，并用0.5体积（〜450ml）氯仿萃取。使用与2所述相同的提取程序，除了现在应该收集和保存有机层。进行三次萃取，然后收集有机层，弃去水层（见附注6）。
5. 通过加入〜30g无水Na 2 SO 4从有机提取物中除去残留的水，并轻轻地旋转混合物。加入无水Na 2 SO 4，直到其不再形成团块，表明所有的残余水已被吸收。
6. 使用0.45μm聚丙烯膜过滤器和连接到真空泵的玻璃过滤器组件过滤有机萃取物。用新鲜氯仿洗涤含有有机提取物的烧杯以及过滤器组件，以回收所有残留的提取物
7. 使用旋转蒸发器将有机萃取液浓缩至〜100ml。蒸发器加热浴（充满水）应设定为50℃，冷凝器应冷却至50％v/v乙二醇的循环溶液（使用冷藏循环浴冷至-10℃）。 ;
8. 将50ml有机浓缩液转移到两个125ml分液漏斗中的每一个中。用0.5体积（25毫升）的0.5M KHCO 3水溶液萃取每种浓缩物。混合后，通过重力使相分离约5分钟，然后分别收集各相。重复萃取有机浓缩物两次，然后收集收集的水相（给出两组水提取物，各75ml），弃去有机萃取液（见注7）。
9. 用0.5体积（35-40毫升）氯仿洗涤含水萃取液两次。为了洗涤，将氯仿加入到含有水提取物的分液漏斗中，混合，然后放置5分钟以使相分离。收集并丢弃有机层，并重复。洗涤后，将含水萃取液合并（总体积〜140〜150ml）
10. 使用1N HCl（水溶液）（〜12-15ml）将水提取物的pH调节至1-2。酸会导致与KHCO 3的中和反应，产生热量和大量的CO 2。必须缓慢加入酸，否则反应会变得剧烈，会引起酸溅。加入每1ml酸后，轻轻混合溶液直至CO 2分散。
11. 将40ml水提取物倒入四个125ml分液漏斗中的每一个中。用0.5体积（20ml）的氯仿将每个等分试样提取三次。将所有有机萃取液收集并合并在一起，并丢弃水层。在化学品安全罩中的未覆盖的烧杯中将有机萃取物蒸发干燥过夜（见附注8）
制备TLC（见注4）
1. 通过上下移液将干燥的有机萃取物再溶解在含有0.1％v/v甲酸的2-3ml MeOH中。将提取物转移到干净的螺旋盖玻璃瓶中。用额外的1ml MeOH + 0.1％甲酸冲洗烧杯，以回收剩余量的提取物。使用1 ml注射器和0.2μmPTFE膜过滤器将提取物过滤到一个新的螺旋瓶中。
2. 将TLC流动相（参见食谱）倒入TLC显影槽中，并填充至约2厘米的深度。通过将两块12.5厘米的滤纸放入容器中并覆盖该罐至少30分钟，使TLC室中的空气饱和。
3. 用铅笔标记5 x 20厘米分析TLC板，以指示流动相溶液的浸没点（见注9）。
4. 将溶于100％MeOH + 0.1％甲酸的至少30-50μg标准的目标分子（或比较类似物;参见附注10）施用到TLC板上。将标准从板的边缘至少1厘米，并在板上的浸入标记之上至少1厘米。
5. 将约30-50μl的有机提取物沿板宽约2厘米。确保所提取的提取物距离板的边缘至少1厘米，距离板上浸入标记1厘米处，距离之前施加的标准1厘米（见注11）。
6. 从TLC储罐中取出滤纸盘，并将TLC板放入罐中并盖住。允许流动相迁移到板顶部的1厘米（约20-40分钟）内。取出TLC板，使其干燥（约15分钟）。重复此过程。
7. 将空气干燥的TLC板置于紫外线灯下，用铅笔标记所用标准品和有机提取物中所需的 - 焦油酰基植物毒素的位置（图4）。
  
  图4."S"的TLC分析。含有CFA-L-Ile的有机提取物将纯化的样品（50μg）的CFA-L-Ile（i）和小部分（30-50μl）的有机提取物）含有CFA-L-Ile被点样到5×20cm硅胶GF分析TLC板上。分离后，将板在UV光下显现，纯标准品的位置与蓝色矩形中植物毒素的预期位置一起标记（蓝色圆圈）。黑色箭头表示样品在板上的迁移方向。
8. 用铅笔标记制备型TLC板，以指示将浸入流动相溶液中的板的面积。
9. 沿着TLC板的整个宽度施加有机提取物，每次10μl。不要将任何样品放置在板的任一边缘的1厘米内或标记的浸没区域的1厘米内（见附注11）。
10. 从TLC储罐中取出滤纸盘，并将TLC板放入罐中并盖住。允许流动相迁移到板顶部的1厘米（〜1-1.5小时）内。从罐中取出板，并让其风干（约20-30分钟）。将板返回到水箱并重新分开。
11. 将空气干燥的TLC板置于紫外线灯下，用铅笔标记转移到其中的芥子油 - 植物毒素植物的区域（图5;见附注12）。
  
  图5.S的制备TLC分析。含有CFA-L-Ile的sc ies> organic。。。。。>>>。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。（参见图4）。为了确保CFA-L-Ile的完全回收，从板上刮下二氧化硅的大面积（由蓝色矩形表示）。白色箭头表示板上代谢物的迁移方向。
12. 使用金属刮刀的平坦边缘刮去标记的区域以除去硅胶结合的代谢物。将硅胶转移到Falcon锥形管中，加入10ml MeOH + 0.1％v/v甲酸。涡旋混合物，然后在室温下孵育1小时，每10分钟涡旋1分钟
13. 将混合物在室温下离心分离5分钟，使硅胶沉淀。将MeOH提取物转移到干净的Falcon管中。重复硅胶混合物的离心，以尽可能多地回收MeOH提取物。
14. 使用1 ml注射器和0.2μmPTFE膜过滤器过滤MeOH萃取液。使用设定为60℃的干燥加热块将提取物浓缩至1-1.5ml的最终体积（参见附注13）。
半制备RP-HPLC
1. 开始通过C18半制备HPLC柱（保持在50℃的恒定温度）下运行HPLC流动相（30％ACN：70％H 2 O，0.1％甲酸）恒定流速为4 ml/min，直到色谱柱平衡
2. 将50μl样品加入柱中，并使用以下流动相运行条件进行样品分离：保持在30％ACN：70％H 2 O下7.5分钟，然后线性增加至50％ ACN：在12.5分钟的时间内为50％H 2 O。保持在50％ACN：50％H 2 O下5分钟，然后使用7.5分钟的线性梯度返回初始条件。在初始条件下保持至少12分钟，然后开始下次注射（见附注14）。
3. 使用230nm的检测波长监测分离的代谢物，并收集对应于所需的N， - 邻 - 酰基油酰植物毒素的峰的部分（参见附注15）。
4. 重复样品注射，代谢物分离和级分收集，直到使用所有初始提取物。
5. 将收集到的用于所需的N， - 邻 - 酰基油酰植物毒素的馏分进行收集，并使用旋转蒸发器蒸发至干。蒸发器加热浴（充满水）应设置在70℃，冷凝器应用50％v/v乙二醇的循环溶液冷却（使用冷藏循环浴冷至-10℃）。
6. 将纯代谢物重新溶解在3ml MeOH + 0.1％v/v甲酸中。将溶液转移到预先称重的螺旋盖小瓶中，并在设定为60℃的加热块中干燥。
7. 称量小瓶+干燥样品，计算纯化样品的重量。将干燥的样品储存在-20°C直到需要（参见注释16和17）。

笔记

我们已经观察到取决于S的应变的N，N-二十氢酰基植物毒素的生产水平的变化。所使用的sc疮，因此可能需要根据特定菌株的生产效率改变培养物的体积。
大型文化可以孵育多达14天;然而，培养物中存在的代谢物的水平在10天后不会显着增加。
冷冻过程迫使蛋白质和任何其他溶解的物质脱离溶液，然后在第一次氯仿萃取过程中将其去除。这将使随后的提取物更清洁，并且将允许更快和更完整的相分离。建议使用塑料容器冷冻/解冻上清液，因为玻璃烧杯在冷冻过程中可能会破裂。
所有步骤（步骤B2和C8中的离心除外）应在化学品安全罩或通风橱中进行。
该步骤用作纯化步骤，因为许多非羧酸化合物将在所用的碱性pH条件下移入有机相。羧酸，例如N， - 蒽醌酰基植物毒素在高pH下将处于未质子化的形式，因此将保留在水相中。
在所使用的pH条件下，N' - 角鲨烯酰植物毒素呈旋转形式，因此在氯仿中比在水性培养上清液中更易溶。
KHCO 3溶液的pH促进了N， - 邻 - 酰基油酰植物毒素的去质子化和随后的运动进入水相。
该混合阶段产生大量的气体。不要在125ml的漏斗中填充超过75ml的水和有机溶剂。如果漏斗含有超过该体积，气体的表达将强制打开塞子或旋塞，并且提取物将丢失。
执行步骤C3-C7以便确定感兴趣的N，N-二十氢酰基植物毒素的迁移点。将分子的纯样品（约50μg）和少量有机提取物（〜30-50μl）施加到5×20cm分析TLC板上，并使用相同的条件进行分离用于制备TLC步骤。
如果不能获得目标特定的N， - 邻 - 酰基油酰植物毒素的纯标准，则可以代替使用N，N-二十氢酰甲酰基植物毒素冠状病毒（COR）。该植物毒素可从Sigma-Aldrich Canada（目录号：C8115）购买。
为获得最佳效果，请确保在将新提取物应用于同一区域之前，点样提取物已经空气干燥。
目的基因分析TLC板上的目的蛋白质-NO-海胆酰基植物毒素的位置将不完全对应于制备型TLC板上的植物毒素位置（如图4和5所示）。然而，通过比较参考板上的标准品和提取物条带的相对位置，可以估计制备型TLC板上的植物毒素的位置。由于目的在于制备TLC板上不同的条带或片段，但是作为黑色涂片，所以推荐将至少1cm的面积超过这个涂片被标记。
不要将样品浓缩到低于此值的体积，否则代谢物可能沉淀出溶液
描述的HPLC运行条件适用于从提取物中的其他代谢物中分离CFA-L-Ile冠醚酰基植物毒素。然而，如果产生含有其他异亮氨酸异构体（例如，异亮氨酸）的次要的N， - 大茴香酰植物毒素，则它们不会与CFA-L-Ile代谢物分离并将被共同纯化。另外，如果其他的N -/- 巨氢酰基植物毒素或生物合成中间体被靶向用于纯化，则可能需要相应地调整HPLC流动相运行条件以便获得这些代谢物的良好分离。
使用HPLC柱和所述的运行条件，CFA-L-Ile冠醚酰基植物毒素的保留时间为18-19分钟（图6）。
纯化的代谢物也可以重新溶解在MeOH + 0.1％甲酸中，最终浓度为1 mg/ml，然后储存在-20°C。
为了确认代谢物的纯度，可以使用液相色谱 - 质谱（LC-MS）分析样品，如其他地方所述（Bown等人，2016）。

图6.通过半制备型RP-HPLC纯化CFA-L-Ile。在通过制备型TLC纯化后，将含CFA-L-Ile的提取物加载到C18半制备型HPLC柱，并通过测量230nm处的吸光度来监测代谢物。对应于CFA-L-Ile的峰由星号表示，是由HPLC馏分收集器收集的该峰。请注意，由于提取物中CFA-L-Ile含量高，吸光度读数超过检测器测得的最大值，因此色谱图中出现峰值。另外，由于含有不同异亮氨酸异构体的N - 诺卡非酰甲基植物毒素有时可以通过S来产生。 SFMB中的sc疮，收集的峰可能含有不同异构体的混合物，因为它们在HPLC纯化期间不会分离出来（Bown等人，2016）。

食谱

大豆面粉甘露醇肉汤（SFMB）培养基（Kieser等人，2000）
20克/升大豆粉
20g/L D-甘露糖醇
将甘露糖溶解在水中
添加大豆粉
高压消毒灭菌
制备型TLC流动相（Fyans等人，2015）
195ml乙酸乙酯
4毫升2-丙醇
0.5ml乙酸
0.5 ml水

致谢

这项工作得到加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC），加拿大创新基金会（CFI）以及纽芬兰和拉布拉多研究与发展研究院的资助。发展公司（RDC）到D.R.D.B.磅。得到了纪念大学研究生院研究生的支持。该协议基于最初在Bown等人中报告的工作。（2016）和Fyans等人。（2015）。

参考文献

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Bown，L.，Altowairish，MS，Fyans，JK和Bignell，DR（2016）。寻找更好的马铃薯常见痂的管理。土豆研究 55（3）：249-268。
Fyans，JK，Altowairish，MS，Li，Y.和Bignell，DR（2015）。由常见的痂病原体耻骨链球菌痉挛产生的类冠状动植物毒素的表征。 Mol Plant-Microbe Interact 28（4 ）：443-454
Mitchell，RE和Frey，EJ（1986）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://mic.microbiologyresearch.org/content/journal/micro/10.1099/00221287-132-6-1503 "靶="_ blank">通过丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）生产冠状病毒的n 非酰基酰基-L-氨基酸类似物。补充有L-氨基酸的液体培养物中的 atropurpurea 。微生物学 132（6）：1503-1507。
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Palmer，DA and Bender，CL（1993）。效果的环保和营养因素通过丁香假单胞菌生产聚酮化合物植物毒素冠状病毒。大肠杆菌。 Appl Environ Microbiol 59（5）：1619-1626。