材料和试剂

带有过滤帽的T25细胞培养处理过的烧瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：136196）}
Eppendorf Safe-Lock微量离心管（Eppendorf，目录号：022363204）
5Prime Phase Lock凝胶管重2毫升（Quantabio，目录号：2302830）
具有过滤帽的T75细胞培养处理的烧瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：178905）}
Greiner 50ml离心管（Greiner Bio One International，目录号：227261）
Greiner细胞刮刀（Greiner Bio One International，目录号：541081）
24孔细胞培养处理的多片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：142475）}
96孔微孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：156545）}
96孔PCR板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：AB0700）}
6孔细胞培养处理多片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：140675）}
铝箔胶带（3M，目录号：425DWB）
Illustra Microspin S-400 HR柱（GE Healthcare，目录号：27-5140-01）
Immobilon-FL PVDF转移膜（EMD Millipore，目录号：IPFL00010）
Whatman 3 MM chr纤维素吸印片（GE Healthcare，目录号：3030-917）
0.22μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGV033RS）
AAV-293细胞系（Agilent Technologies，目录号：240073）
HCT 116细胞系（ATCC，目录号：CCL-247）
Cas9 D10A切口酶突变体（nCas9）（Addgene，目录号：48140和62987）
pAav-MCS-PQS1-3xFLAG或pAav-MCS-PQS2-3xHA（Addgene，目录号：分别为84883和84917）
pDG rAAV包装质粒（PlasmidFactory，目录号：PF421）
野生型Cas9表达载体（Cas9）（Addgene，目录号：48138和62988）
选择的感染细菌细胞（例如，，TOP10或DH5α）
Surveyor Mutation Detection Kit（综合DNA技术，目录号：706025）
UltraPure苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，v/v）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen公司，目录号：15593031）
氯化钠（NaCl）分子生物学级（EMD Millipore，目录号：567441）
2-丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：278475）
乙醇（EMD Millipore，目录号：100983）
AccuPrime Pfx DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：12344-024）}
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：449709）
DMEM，高葡萄糖GlutaMAX培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：31966047）}
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010023）}
Benzonase核酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：E1014）
AAV纯化Vira Kit 3使用（Virapur，目录号：003063）
AAV无辅助系统（Agilent Technologies，目录号：240071）
McCoy的5A培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：16600082）}
Opti-MEM I减少血清培养基，GlutaMAX补充剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：51985026）}
Fugene HD转染试剂（Promega，目录号：E2311）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10500064）}
胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25300096）}
嘌呤霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P8833）
结晶紫溶液（Sigma-Aldrich，目录号：HT90132）
遗传霉素/G418（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11811031）}
Go Taq G2热启动聚合酶（Promega，目录号：M7405）
dNTP 100mM PCR级（Agilent Technologies，目录号：200415）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
TAT-Cre重组酶（Excellgen，目录号：EG-1001）
NucleoSpin凝胶和PCR清除试剂盒（Machery-Nagel，目录号：740609）
随机引物DNA标记试剂盒（Takara Bio，目录号：6045）
[α-³² P] dCTP，50μCi（PerkinElmer，目录号：BLU013H250UC）
不含Klenow酶（New England Biolabs，目录号：M0212S）
SuRE/Cut缓冲液H（Roche Diagnostics，目录号：11417991001）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A4503）
生态 RI 40 U /μl（Roche Diagnostics，目录号：10200310001）
Nytran SuPerCharge TurboBlotter Kit（Sigma-Aldrich，目录号：Z613924）
注意：本产品已停产。
PerfectHyb加杂交缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：H7033）
4-12％标准XT Bis-Tris蛋白凝胶18孔，30μl（Bio-Rad Laboratories，目录号：3450124）
小鼠单克隆抗FLAG M2抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F3165）
或大鼠单克隆抗HA高亲和力（Roche Diagnostics，目录号：11867423001）
Zero Blunt PCR Cloning Kit（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：K270020）}
NucleoSpin质粒EasyPure（Machery-Nagel，目录号：740727）
Tris超纯级（MP Biomedicals，目录号：02103133）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：436143）
来自曲霉属相册的蛋白酶K 800 U/ml（Sigma-Aldrich，目录号：P4850）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：255793）
直接溶解试剂（细胞）（VIAGEN BIOTECH，目录号：301-C）
CHAPS水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C5070）
蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：11697498001）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：30721）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
柠檬酸三钠脱水剂[HOC（COONa）（CH 2 COONa）2/2H 2 O]（Sigma-Aldrich，目录号：C8532 ）
SmartLadder（Eurogentec，目录号：MW-1700-10）
Phase Lock裂解缓冲液（见配方）
TE缓冲（见配方）
2x HEBS（HEPES缓冲盐水）（参见食谱）
rAAV细胞裂解缓冲液（参见食谱）
直接PCR裂解缓冲液（参见食谱）
CHAPS裂解缓冲液（参见食谱）
去除缓冲液（见配方）
变性缓冲液（见配方）
中和缓冲（见配方）
20x SSC（见配方）
洗涤缓冲液1（参见食谱）
洗涤缓冲液2（参见食谱）
洗涤缓冲液3（参见食谱）

设备

BSL2细胞培养设施
Thermoshaker
涡流（例如，IKA，型号：MS2 minishaker）
用于细胞培养的倒置显微镜（例如，Carl Zeiss，型号：Axiovert 25）
非循环水浴
250毫升无菌储存瓶（康宁，目录号：430281）
热循环仪（例如，Bio-Rad Laboratories，型号：T100 热循环仪，目录号：1861096）
蛋白质印迹设备，例如，
标准垂直电泳池（Bio-Rad Laboratories，目录号：1656001）
具有平板电极的标准吸墨纸（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704070）
GS基因接头UV室（Bio-Rad Laboratories，model：GS Gene Linker ^TM UV Chamber）
荧光成像仪装置（例如，GE Healthcare，型号：Typhoon 9200）
应使用放射性标记的核苷酸（[α-³² P] dCTP）所需的设施和程序（例如废物处理程序）
台式离心机（Eppendorf，型号：5430 R）

程序

设计目标靶基因的引导RNA（gRNA）构建体
1. 将编码感兴趣蛋白质C末端区域的基因组序列插入到选择的引导设计工具中（例如， crispr.mit.edu ）。在大多数情况下，围绕终止密码子的总长度为250个核苷酸的输入序列具有足够的PAM基序用于设计工具以产生多个引导序列。
2. 选择靠近C-terminal的导游。在定义指南时，请牢记潜在的脱靶效应。大多数设计工具通过基于目标基因组中的目标命中得分来排列潜在的指导，直接提供这些信息
3. 克隆指南在一个Cas9表达载体的选择。建议使用Cas9 D10A切口突变体（nCas9，Addgene质粒＃48140和＃62987）以尽量减少脱靶裂解事件。或者，野生型Cas9表达载体也可用于Addgene（质粒＃48138和＃62988）。构建体的详细克隆程序由Ran等人描述。（2013）。当使用Cas9 D10A切口（nCas9）时，保持引导对之间的最小偏移，以确保最佳效率。
  注意：建议在单独的实验中评估多种gRNA的切割效率。这可以通过转染构建体并对所选择的细胞群进行错配切割测定（例如，测量子错配切割测定）来完成（Qiu等人，2004）。我们通常对每个感兴趣的基因组区域测试2-3种不同的gRNA。在使用nCas9的情况下，建议测试2-3对gRNA。

通过PCR扩增同源区域来生成rAAV靶向构建体使用由PQS1肽（Vandemoortele等人，2004）和3xFlag标签组成的组合标签的C-末端标签的骨架质粒已经沉积在Addgene（质粒＃84883）上。含有PQS2肽和3xHA标签的该靶向构建体的替代形式也可在Addgene（质粒＃84917）上获得。可以通过标准克隆程序将5'和3'同源区（HR）插入到这些质粒中存在的多个克隆位点。

使用酚提取和乙醇沉淀方案制备基因组DNA（gDNA）

通过在室温（RT）下以500×g离心5分钟，分离并沉淀相当于Eppendorf管中的亚汇合T25烧瓶的2.5×10 6个细胞。 >
加入500μlgDNA Phase Lock裂解缓冲液（参见食谱）至沉淀，并在37℃下孵育过夜。
加入裂解液之前，通过快速离心法将相锁管旋转下来。在转移到锁相管之前摇匀裂解物样品。
加入500μl苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1，v/v），并剧烈振荡1分钟。
在室温下以16,000×g离心相锁定管3分钟。将水相转移到新鲜的Eppendorf管中，加入50μl3 M NaCl和500μl2-丙醇。反复管后可以观察到基因组DNA几次
在室温下以16,000 x g离心2分钟。弃去上清液，加入1 ml 70％乙醇至DNA沉淀。倒置几次，室温孵育5分钟。在室温下以16,000×g离心2分钟。
丢弃上清液。将沉淀物在52℃下空气干燥5分钟，然后将沉淀重新悬浮在100μl10mM TE缓冲液pH7.5中。允许颗粒溶解1小时通过在65℃下在热心机中孵育。测量基因组DNA浓度。

设计引物，用适当的突出限制位点扩增HR，以插入骨架质粒注意：建议使用至少650bp的HR。据报道，较短的HR显着降低同源重组潜力（Vasileva等，2006）。反向末端重复（ITR）序列之间的全长超过4.7kb的靶向构建将阻碍rAAV的包装效率（Wu et al。，2010）。

准备PCR混合物

10x AccuPrime 反应混合物	5μl
正向引物（10μM）	1.5μl
反向引物（10μM）	1.5μl
AccuPrime Pfx DNA聚合酶	0.5μl
gDNA（100ng /μl）	1μl
ddH ₂ O	40.5μl

使用触地式PCR程序扩大人力资源。根据人力资源的长度（1分钟/kb）调整斜体延长时间。
在进行克隆步骤之前，通过琼脂糖凝胶电泳验证和纯化PCR产物注意：由于上述骨架结构包含位于新霉素选择盒侧翼的多个克隆位点（MCS），所以可以使用不同的限制酶位点进行最终靶向构建体的克隆。替代的克隆方法（例如，Gibson装配，In-Fusion）也与这些载体兼容。

rAAV生产和净化
1. AAV-293转染
  1. 在转染前24小时，加入4×10 6个AAV-293细胞的种子10T75烧瓶。
  2. 在转染前至少30分钟吸出并加入新鲜生长培养基。
  3. 为每个T75准备DNA转染混合物。
    
    pAAV靶向构建体（1μg/μl）
    15μl
    
    pDG（1μg/μl）
    30μl
    
    2.5M CaCl 2
    75μl
    
    ddH ₂ O
    630μl
    
    注意：pDG质粒用作rAAV包装的辅助质粒。 pDG包含所有必需的AAV和腺病毒功能，以确保扩增和包装（r）AAV载体。
  4. 将DNA转染混合物滴加到750μl2x HEBS（参见食谱），同时使用涡流以确保充分混合。在室温下孵育10分钟。
  5. 将转染混合液以一种逐滴的方式转移到细胞中注意：转染的AAV-293细胞和纯化的rAAV病毒应在此之后在BSL-2设施中处理。
  6. 在转染24小时后用12ml新鲜的DMEM生长培养基代替生长培养基，再孵育48小时注意：在更换生长培养基之前，应使用光学显微镜通过目视检查在转染的细胞之间发现细小的沉淀物。磷酸钙-DNA沉淀有助于通过胞吞作用进入细胞之前DNA与细胞表面的结合。次优转染缓冲液（例如2x HEBS）或DNA质量可影响沉淀物形成，导致低转染效率。由于转染可能会导致生长受损。
2. rAAV颗粒的收获和净化
  1. 在50ml管中收集分离细胞的生长培养基。
    注意：在rAAV生产期间，细胞可能会分离。用于生产的所有T75猎鹰的生长培养基的总量相当于4×50ml管，以方便进一步的纯化步骤。
  2. 使用细胞刮刀将细胞收集在1.5ml PBS/T75烧瓶中，并将细胞悬浮液加入到50ml管中。以500×g离心细胞3分钟，并将上清液转移到新的50ml管中。
  3. 将2.5ml PBS加入到获得的细胞沉淀中，重新悬浮细胞沉淀并将所有细胞悬浮液组合在一个新管中。以500×g离心3分钟，并将细胞沉淀重新悬浮于3ml rAAV裂解缓冲液中。
  4. 主题丸至3次冻融循环，循环之间短暂涡旋。将裂解物转移到步骤C2b的上清液。
    注意：未经纯化的病毒可以储存在-80°C。在使用37°C水浴进行净化之前，应将管解冻，同时旋转管道以保持低温。
  5. 在4℃下以900×g离心管30分钟。将上清液收集在250 ml无菌瓶中，加入Benzonase核酸酶（最终浓度为50 U/ml）
  6. 使用VIRAPUR AAV纯化试剂盒根据制造商的方案纯化rAAV颗粒。纯化病毒应储存在-80°C等份，直至使用。
HCT116细胞的转染和感染
1. 种子2.7×10 5个HCT116细胞/孔在含有1ml McCoys生长培养基的24孔板中。
2. 在单独的管中准备以下混合物。
  
  FugeneHD混合
  
  DNA混合物
  
  Opti-MEM
  11.7微升
  Opti-MEM
  11.7微升
  
  Fugene HD转染试剂
  1.4μl
  Cas9 + gRNA质粒DNA
  0.5μg
  
  将Fugene HD混合物轻轻添加到DNA混合物中，轻轻敲打管，并在室温下孵育混合物10分钟。在该孵育步骤中，用250μlOpti-MEM替换HCT116细胞上的培养基注意：在转染过程中，McCoys生长培养基被Opti-MEM所代替，因为基于Fugene的转染的细胞毒性可能由于生长培养基（例如青霉素和链霉素）中存在抗生素而增加。 >
3. 将Fugene HD-DNA混合物滴加到HCT116细胞中。
4. 转染后6〜8 h，向细胞中加入250μl含有20％FBS的McCoys培养基。
5. 转染后24小时用胰蛋白酶分离细胞。将一半的细胞悬浮液转移到T25烧瓶中。可以将剩余的细胞丢弃或用作步骤D7中描述的未感染的G418对照群体。
6. 在1 ml McCoys生长培养基中稀释50μlrAAV病毒，并在接种于T25烧瓶后24 h将混合物加入转染细胞。
  注意：如果菌落数明显低于预期（图2），感染体积可以增加到150μl甚至500μl。在使用嘌呤霉素或基于EGFP的细胞分选感染前，张实验室（见材料）选择用CRISPR-Cas9质粒转染的细胞是可选的。在大多数实验中，完全依靠遗传霉素/G418选择进行富集就足够了，因为这是目标基因组中rAAV盒插入的直接指标。此外，在G418选择之前用嘌呤霉素或FACS分选处理细胞可能对存活有不利影响。
  
  图2.在G418选择14天后，rAAV感染（左）和未感染的HCT116细胞（右）的结晶紫染色。结晶紫染色显示耐G418的细胞灶。 >
7. 转染后72 h，以1 mg/ml的浓度将G418加入细胞注意：另外感染的HCT116群体和未感染的HCT116群体进行G418选择，以评估G418抗性细胞病灶或菌落的结晶紫染色的感染效率。预期的染色结果如图2所示。
8. 分离细胞并在培养达到70％融合时添加新鲜的G418补充生长培养基。选择14天后，通过手动稀释在96孔板中种单个HCT116细胞。在96孔板中保持1 mg/ml G418选择。
  注意：在典型的手动稀释步骤中，将细胞分离，计数并稀释至10,20和40细胞/ml。对于每个密度（1,2或4个细胞/孔），通过在预先填充有100μl生长培养基的96孔组织培养板的每个孔中移取100μl稀释的细胞悬浮液来接种一个板。建议种子不同的密度，以确保有单个细胞的足够的井。
9. 通过使用光学显微镜的目视检查，在播种后一周筛选每个孔以克隆细胞群体的存在
10. 一旦大多数克隆群体达到约70％汇合（图3），可以开始克隆细胞群体的PCR筛选（图4）。
  
  图3. HCT116克隆群体的典型视图。一旦大多数确定的群体达到70％融合，就可以开始基于PCR的筛选。左：扩大殖民地右：殖民地准备进行筛选。比例尺=100μm

基于PCR的筛查同源性修复事件
用于PCR筛选的不同引物如图4所示。建议设计包含HR与侧翼基因组DNA序列连接的HR筛选PCR反应，以避免检测随机整合事件（假阳性）。随机整合事件可以通过Southern印迹检测（步骤G2和数据分析部分）。

图4.在单个等位基因上的rAAV介导的CRISPR诱导的双链断裂的同源性定向修复。在本方案中用于筛选的不同引物对以分开的颜色表示。蓝色引物：5'HR筛选引物;绿色引物：3'HR筛选引物;黑色引物：选择盒去除（CR）筛选引物对;红色引物：用于产生Southern印迹DNA模板（SBDT）的引物对;灰色箭头：反向末端重复（ITR）;蓝色条纹三角形：loxP序列; TAG：表位标签;选择盒：磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子控制下的新霉素抗性基因;紫色元素：切口酶Cas9（nCas9）对。

PCR筛选板的产生和裂解
1. 将20μl直接PCR裂解缓冲液（见食谱）吸管至新的96孔PCR板。
2. 从包含克隆细胞群的96孔板中除去生长培养基。在用25μl胰蛋白酶分离细胞之前用PBS洗涤一次。将5μl分离的细胞转移到预先用PCR裂解缓冲液预填充的PCR板上并用铝箔带覆盖。快速地向96孔组织培养板中的剩余细胞悬浮液中加入200μl标准生长培养基用于进一步培养。将96孔PCR板置于热循环仪中，并将样品送至以下程序：
  
  15分钟
  55°C
  
  45分钟
  85°C
  
  ∞
  4°C
  
  注意：裂解后，96孔PCR板可以在2-8℃下储存直到PCR筛选。

PCR扩增

使用每个克隆的裂解材料作为输入DNA进行跨越5'HR的PCR反应，以使用步骤B4中描述的程序来评估修复模板的rAAV介导的整合。

5x无色Go Taq Flexi缓冲区	4μl
5'HR Fwd引物（100μM）	0.15μl
5'HR Rev引物（100μM）	0.15μl
dNTP（25 mM each）	0.2μl
MgCl 2（25mM）	1.2μl
DMSO	1.2μl
ddH ₂ O	10.9μl
去 Taq （5 U /μl）	0.2μl
裂解物质	2μl

通过琼脂糖电泳评估扩增。每个阳性克隆与3'HR引物重复反应

5x无色Go Taq Flexi缓冲区	4μl
3'HR Fwd引物（100μM）	0.15μl
3'HR Rev引物（100μM）	0.15μl
dNTP（25 mM each）	0.2μl
MgCl 2（25mM）	1.2μl
DMSO	1.2μl
ddH ₂ O	10.9μl
去 Taq （5 U /μl）	0.2μl
裂解物质	2μl

通过琼脂糖电泳分析扩增
阳性克隆扩大并冻结。

Tat-Cre介导的选择盒去除
1. 来自步骤E的种子PCR阳性克隆在96孔板的单独孔中，密度为1×10 3个细胞/孔。
2. 在接种后24小时向每个孔添加终浓度为2.5μM的TAT-Cre重组酶。
3. 在加入新鲜生长培养基的TAT-Cre孵育24小时后，用DPBS洗涤两次。在TAT-Cre处理4天后，通过手动稀释96孔板，细胞准备进行单细胞接种。

最终克隆的筛选和验证
注意：本节中描述的检测通常按顺序执行。

PCR扩增

按步骤E1所述制备裂解板。
通过PCR使用步骤B4中描述的程序验证选择盒的切除。在未经处理的阳性克隆上也进行PCR反应以获得没有成功重组的克隆的参考（参见下文步骤G1c中的注释）。

5x无色Go Taq Flexi缓冲区	4μl
CR Fwd引物（100μM）	0.15μl
CR Rev引物（100μM）	0.15μl
dNTP（25 mM each）	0.2μl
MgCl 2（25mM）	1.2μl
DMSO	1.2μl
ddH ₂ O	10.9μl
去 Taq （5 U /μl）	0.2μl
裂解物质	2μl

通过琼脂糖电泳分析扩增子大小。使用用于操作DNA序列的软件的盒式计算机移除可用于定义扩增子的预期长度。
注意：由于新霉素选择盒中启动子的扩增子的大小和GC含量，难以获得无重组的克隆的成功PCR。

Southern印迹

PCR使用步骤B4中所述的PCR程序扩增一部分新霉素抗性盒。用NucleoSpin凝胶和PCR清除试剂盒纯化PCR产物。

10x AccuPrime 反应混合物	5μl
SBDT正向引物（10μM）	1.5μl
SBDT反向引物（10μM）	1.5μl
AccuPrime Pfx DNA聚合酶（2.5U /μl）	0.5μl
rAAV靶向构建体（1ng /μl）	10μl
ddH ₂ O	31.5微升

SBDT Fwd底漆	5'-TGCTCCTGCCGAGAAAGTAT-3'
SBDT Rev底漆	5'-GCGATGCAATTTCCTCATTT-3'

使用随机引物DNA标记试剂盒变性模板DNA

模板DNA（50 ng /μl）
1μl

随机引物
2μl

ddH ₂ O
11μl
煮5分钟将冰冷的样品在冰上保存5分钟。添加以下混合样品：

10倍缓冲区
2.5μl

dNTP混合物（每个0.2mM）
2.5μl

[α-³² P] dCTP（50μCi）
5μl

不含Klenow酶的
1μl
在37℃下孵育20分钟。通过在65℃下孵育5分钟来灭活无exo-free Klenow酶。沸腾样品3分钟。
注意：应采取适当的保护措施，使用[α-³² P] dCTP和使用该试剂产生的标记探针。
根据制造商提供的方案，使用Illustra Microspin S-400 HR色谱柱纯化探针。
如步骤B1所述，制备所选克隆的10μg500 ng /μlgDNA。在37℃下用生态环境消化一夜。

gDNA（500ng /μl）
20μl

SuRE /剪切缓冲区H
3μl

0.1％BSA
0.3μl

生态 RI（40 U /μl）
0.5μl

H ₂ O
6.2μl
通过0.7％琼脂糖凝胶电泳分离消化的gDNA。根据以下方案，在不同的缓冲液中孵育凝胶（参见食谱）：

去除缓冲液
10分钟

变性缓冲液
2 x 15分钟

中和缓冲区
2 x 15分钟

20x SSC
10分钟

注意：用0.5％SDS和热水彻底冲洗电泳槽和凝胶托盘，以使Southern印迹上的背景信号最小化。在TAT-Cre处理之前，将克隆的基因组DNA包含在Southern印迹中作为对照样品。
使用Nytran SuPerCharge TurboBlotter套件过夜。
在2x SSC中洗涤膜5分钟（参见食谱）。使用程序C3（150mJ×254nm UV照射）在GS基因接头UV室中的Whatman纸上（在2x SSC中预润湿）的交联。
将膜转移到含有PerfectHyb plus杂交缓冲液的管中预热至68℃。在68°C孵育1小时。
变性放射性探针沸腾10分钟。在冰上保存2分钟。
在新鲜预热的PerfectHyb加缓冲液中，将25μl变性探针加入到膜中。在68°C孵育过夜。
用洗涤缓冲液1冲洗膜三次（参见食谱）。按照以下方案洗膜。

洗涤缓冲液1
10分钟

洗涤缓冲液2
15分钟

洗涤缓冲液3
10分钟

注意：洗涤缓冲液2和3（见食谱）应预热至65°C。
在磷光体屏幕上过夜曝光后的磷光体装置上的图像。

蛋白质印迹
1. 将每个克隆的亚融合T25烧瓶溶解在100μlCHAPS裂解缓冲液（参见Recipes）中。在离心悬浮液10分钟之前，在冰上孵育5分钟> 16,000 x g 在桌面离心机中。将上清液转移至新管。
2. 通过Bradford测定法测定蛋白质浓度。在SDS-PAGE上载入50μg蛋白质物质。在蛋白质膜上印迹后，修饰的内源蛋白质可以通过（标签）特异性一级抗体（即，根据选择的骨架质粒）来显现，即抗FLAG或抗HA。
桑格测序。
1. 按照步骤B1所述准备每个克隆的gDNA。
2. PCR分别使用步骤B3和B4中描述的PCR混合物和程序扩增感兴趣的区域。纯化PCR片段，并使用Zero Blunt PCR克隆试剂盒在pCR-Blunt载体中连接
3. 在选择的有效细菌细胞（例如，TOP10或DH5α）中转化，并使用NucleoSpin Plasmid EasyPure Kit制备质粒DNA。可以用M13正向和反向引物测序pCR-Blunt插入片段。
  
  M13转发
  5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'
  
  M13反向
  5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'
  
  注意：由于大多数克隆对于所需的修饰是杂合的，所以应该发送每个克隆的多个质粒进行测序，因为pCR-Blunt质粒还将含有未修饰等位基因的扩增子。 >

数据分析

用于验证所选克隆的不同分析选项是直接测定，通常导致非模糊数据。 G418选择克隆后的PCR步骤确保了表位标签和选择盒在基因组正确位置的整合。 PCR结果对于同源性臂均应是阳性的，以确定缺乏异常重组事件。通常还通过Southern印迹分析这些克隆以确认存在单个盒。可能发生随机整合，导致在选择的PCR阳性克隆中存在另外的构建体。应该消除在Southern分析中显示额外条带的细胞克隆以供进一步使用。
在基于Cre的去除选择盒后，跨越修饰位点和LOX瘢痕的PCR分析应该导致正确大小的条带。如上所述，由于插入物的大小和选择盒中的启动子的GC含量，其中除去选择不成功的克隆的PCR可能失败。应该消除用于修饰位点的PCR反应失败的克隆进行进一步分析。
当探针针对新霉素抗性基因时，Southern分析进一步确认了盒的去除。在TAT-Cre处理之前显示多个频带的克隆被省略用于进一步验证，因为这些附加频带指向（a）随机积分事件。在Southern印迹后，选择经过克隆处理的具有残留条带的克隆不用于进一步分析。
Western分析应该证实目标蛋白上存在表位标签。然而，这意味着蛋白质被充分表达以允许通过Western印迹检测。在一些情况下，刺激或稳定剂（例如，蛋白酶体抑制剂）可以加入到细胞中以增加蛋白质的水平（例如，MDM2， Vandemoortele等人，2016）。通过Western印迹检测未标记的蛋白质不一定表示排除细胞系用于进一步分析，但可能使进一步的下游分析复杂化。还要注意，实际的蛋白质表达可能在不同克隆之间变化。附加克隆的测试仍然可以显示具有阳性Western印迹结果的克隆。还要注意，由于可选的剪接，蛋白质处理，翻译后修饰，不正确的注释，等等，蛋白质的大小可以偏离数据库中描述的主要蛋白质同种型。可以用特异性抗体获得蛋白质的大小确认。
需要进行序列验证以确保标签的正确集成，并消除在工程过程中可能发生的具有帧特征或其他突变的稀有克隆。
只有通过所有以前测定的克隆才能进一步进行基因特异性验证测定（例如通过刺激或蛋白质相互作用分析进行调制）。

食谱

锁相裂解缓冲液
20mM Tris-HCl，pH7.5
5 mM EDTA
0.15 M NaCl
0.2％SDS
6 U蛋白酶K从Tritirachium相册
将ddH ₂ O加入500μl
TE缓冲区
10mM Tris-HCl，pH7.5
1 mM EDTA
2x HEBS（HEPES缓冲盐水）
0.28 M NaCl
50 mM HEPES
1.5mM Na 2 HPO 4
800毫升ddH 2 O
调整至pH 7.05
将ddH ₂ O添加到1 L
注意：确切的pH对转染效率至关重要。 2x HEBS可储存于-20°C。避免反复冻融循环。
rAAV细胞裂解缓冲液
0.15 M NaCl
50mM Tris-HCl，pH8.5
使用0.22μm过滤器进行过滤消毒
直接PCR裂解缓冲液
2.1 ml直接PCR裂解试剂（细胞）
CHAPS裂解缓冲液
50 mM HEPES，pH 7.4
100mM NaCl
0.8％CHAPS（w/v）
蛋白酶蛋白酶抑制剂
去除缓冲液
0.25 N HCl
变性缓冲液
1.5 M NaCl
0.5 N NaOH
中和缓冲区
0.5 M Tris，pH 7.4
1.5 M NaCl
20x SSC
3 M NaCl
0.3 M柠檬酸三钠脱水剂
调整至pH 7.0
将ddH ₂ O添加到1 L
灭菌
洗涤缓冲液1
200 ml 10x SSC
10ml 10％SDS
790ml ddH 2 O O
洗涤缓冲液2
100ml 10x SSC
10ml 10％SDS
890毫升ddH 2 O -/-
洗涤缓冲液3
10ml 10x SSC
10ml 10％SDS
980ml ddH 2 O O

致谢

G.V.是由弗兰德斯（FWO）科学研究基金（授权3G050913N）支持的博士生。 S.E.承认FWO的支持（G011312N和3G050913N）。使用该方案构建的细胞系在Vandemoortele等人的"通过使用靶向蛋白质组学量化通用蛋白质肽的蛋白质标记中的额外维度"中有描述。（2016）和Eyckerman等人的"用于消除亲和纯化 - 质谱法中的假阳性的蛋白质组的智能混合"。（2016），doi：10.1038/srep27220和doi：10.1021/acs.jproteome.6b00517。

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