材料和试剂

微量离心管（1.5ml）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：3456）}
注射器过滤器（0.22μm）（亲水性PTFE）（MicroScience Hydraflow，目录号：MS SF13HY022）
玻璃HPLC小瓶（2ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：THC11090500）
隔垫盖（Thermo Fisher Scientific，目录号：THC11090500）
硫酸肝素（来自猪粘膜）（Celsus Laboratories，目录号：HO-03103）
肝素裂解酶I（肝素酶I或肝素酶III，EC 4.2.2.7，[0.5IU]）（IBEX Technologies，目录号：50-010）
肝素裂解酶II（肝素酶II或肝素酶II，无EC编号，[0.5IU]）（IBEX Technologies，目录号：50-011）
肝素裂解酶III（肝素酶III或肝素酶I，EC 4.2.2.8，[0.5IU]）（IBEX Technologies，目录号：50-012）
通过细菌肝素酶对高级猪肝素（Iduron，目录号：HD001-HD008和HD010-HD013）的作用产生的肝素二糖标准
水（蒸馏）（Sartorius arium ^{®超UV过滤;>18.5MΩ）}
牛血清白蛋白（BSA）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：30060727）}
Na 2 HPO 4 H 2 O（EMD Millipore，目录号：106586）
NaOAc（ACS）（EMD Millipore，目录号：1062680250）
CaOAc·xH 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：25011）
氯化钠（NaCl）（99.99％）（EMD Millipore，Suprapur ，目录号：1.06406）
用于调节pH值的1N盐水（HCl）（37％）（EMD Millipore，目录号：100317）和NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
磷酸（85％）（Sigma-Aldrich，目录号：79606）
酶储存缓冲液（参见食谱）
消化媒体（见食谱）
HPLC分析的流动相（见配方）

设备

高效液相色谱（HPLC）机器（Infinity与多波长检测器）（Agilent Technologies，型号：1260）
使用保护柱（Thermo Fisher，强力阴离子交换HPLC柱（4×250mm）（ProPac ^TM PA1，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：039658） Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：039657）}
移液器（0.5-10μl，20-200μl和100-1,000μl）（Eppendorf）
孵化器（BINDER，型号：KBF-115）
旋转器（Cole-Parmer，Stuart，型号：SB3）
离心机（Eppendorf，型号：Minispin ^® plus，目录号：5453000011）

程序

摘要程序
1. 允许接受的酶溶液（50μl）（-80℃）温热至室温，然后用合适的储存缓冲液稀释至500μl，标称每500μl为0.5IU。将等分试样（5μl）冷冻保存（-80℃）直至需要。然而，这5μl等分试样根据供应商的规格含有5mIU的活性;当使用硫酸肝素硫酸酶和下述消化条件测定酶活性时，分别发现肝素裂解酶（HL）I，II和III分别为2.8,5.0和13.8mIU。在开始解聚过程之前，HL活性应独立验证。
2. 用消化培养基（470μl）将肝素或HS（1mg，一式两份）溶于微量离心管（1.5ml）中。
3. 顺序酶添加完成。
4. 消化通过加热终止（100℃，5分钟）。
5. 将样品离心（14,000 x g，10分钟），上清液回收。
6. 然后将上清液（2mg/ml）用水精确稀释，得到100μg/ml溶液，通过取50μl上清液并加入950μl水。然后将100μg/ml溶液过滤（0.22μm）并分析。
分析程序
1. 使用二元溶剂系统和在40℃下1ml/min的流速完成HPLC。在长期储存后，在注入第一个样品之前，将柱用水充分冲洗，然后用100％B冲洗10分钟，然后用起始条件（0％B）平衡柱2分钟。采用自动进样器（50μl注射体积）注射摘要和标准溶液（参见下文），使用0％B（1分钟），0％至35％B（超过31分钟），35％梯度系统分离二糖，35％ 65％B（超过15分钟），100％B（10分钟）。后分析柱重新平衡0％B（3分钟）
2. 通过吸光度在232nm的最大吸光度下检测二糖
3. 通过溶解12种肝素衍生的二糖标准品（作为1.0mg样品提供）中的每一种制备每种二糖标准物的标准曲线，得到1mg/ml储备液在水中。这些储备溶液又用于制备含有20μg/ml每种标准物的十二个二糖标准混合物，随后连续稀释以制备每种二糖含有10,5,25,225,0.625和0.3125μg/ml的溶液。这些标准解决方案用每批消化分析（见图1）进行分析。线性校准曲线（浓度对峰面积）R< 2>值>可以生成0.998。
4. 对于酶消化，报告的数据是两个消化的平均值。每份摘要通过HPLC分析一式两份（图1）。可以通过相对于十二肝素衍生的二糖标准品的洗脱时间来鉴定消化中的二糖并使用校准曲线进行定量。
  
  图1.显示标准混合物中存在的十二个肝素衍生的二糖的分辨率的HPLC色谱图。保留时间和种类：2.158分钟，Δ-UA-GlcN; 5.092分钟，Δ-UA-GlcNAc; 6.567分钟，Δ-UA-GlcN（6S）; 8.425分钟，Δ-UA（2S）-GlcN; 12.175分钟，Δ-UA-GlcNS; 14.817分钟，Δ-UA-GlcNAc（6S）; 16.942分钟，Δ-UA（2S）-GlcNAc; 24.092分钟，Δ-UA（2S）-GlcN（6S）; 26.233分钟，Δ-UA-GlcNS（6S）; 28.950分钟，Δ-UA（2S）-GlcNS; 36.208分钟，Δ-UA（2S）-GlcNAc（6S）; 44.775分钟，Δ-UA（2S）-GlcNS（6S）。最初通过在上述色谱条件下分别运行各物种来确定十二二糖标准品的洗脱顺序。

数据分析

硫酸乙酰肝素酶消化物的典型HPLC色谱图如图2所示

图2.商业猪粘膜硫酸乙酰肝素的典型酶消化物的HPLC色谱图，显示了Δ-二糖成分的分离。标有星号的峰代表在色谱运行中可重复出现的未表征的物质。 >
使用每个二糖峰的标准曲线和积分区域，可以确定样品中存在的每种二糖的比例。该数据可用于计算每种二糖的归一化比例和通过消化产生的二糖的总质量（表1）。
报道的组合物是四个HPLC运行的平均值;对每个样本完成的两个摘要的重复分析。

表1.商业猪粘膜硫酸乙酰肝素的二糖标准化组成和质量回收

笔记

使用与上述相同的条件并使用上述材料和方法中指定的参考HS测试酶活性。
在HPLC痕迹中观察到的一些二糖的分裂峰归因于还原糖部分的两个端基异构形式。重要的是要保持一致并定量个别的异头物种（Beccati等人，2016），或者如本协议中一样，将峰面积合并用于从样品消化物定量二糖。 >
具有N-未取代的胺基并且没有硫酸化的二糖（ΔUA-GlcN）在该离子交换柱上定量是有问题的。应注意确保在柱上不良保留的物种不与溶剂前体共洗脱并提供错误的值。
在消化物的色谱图中再现性地检测到一些额外的峰（参见图2上标记的物质）。这些暂时归因于由不完全的酶解聚而产生的四糖，但尚未被充分表征
使用该SAX-HPLC方法产生的数据可用于量化由肝素裂解酶解聚产生的不饱和二糖的总质量，理论上应提供关于硫酸乙酰肝素的纯度的指导。然而，如果存在肝素或不易于酶促解聚的特异性连接，则使用该方法测定的解聚程度在纯度计算中可能是误导的（Yamada等人，1993; Carnachan et al。，2016; Mulloy等人，2016）。
在分析未知HS材料期间，本协议（Celsus）中描述的参考HS总是被一次消化和分析，以确保该协议在预期内运行。

食谱

酶储存缓冲液
肝素裂解酶（HL）与BSA（0.1％，w/v）一起储存在通过加入Na 2 HPO 4 H·H 2 O 3制备的50mM磷酸钠缓冲液中> 2 O到RO水，通过加入浓磷酸调节pH值，给出HL I和II的pH 7.1，HL III的pH 7.6。将100mM NaCl加入仅用于HL I的存储缓冲液中
消化媒体
NaOAc（100mM）与CaOAc（2mM），通过加入1N NaOH或HCl调节pH至7.0
用于HPLC分析的流动相
制备水（洗脱剂A）和2M NaCl（水溶液，洗脱剂B），并在分析前立即用1N HCl调节至pH 3.5。

致谢

这项研究部分得到了新西兰商业，创新和就业部以及新西兰创新网络（KiwiNet，VL001298）的支持。 Simon M. Cool博士，Victor Nurcombe博士和R. Alex A. Smith博士（新加坡免疫科学与技术研究所医学生物研究所）的合作研究得到了认可。

参考文献

Beccati，D.，Lech，M.，Ozug，J.，Gunay，NS，Wang，J.，Sun，EY，Pradines，JR，Farutin，V.，Shriver，Z.，Kaundinya，GV和Capila，I. （2016）。使用正交分析技术的综合方法表征硫酸乙酰肝素结构。糖酵母J 34（1）：107-117。
Carnachan，SM，Bell，TJ，Sims，IM，Smith，RA，Nurcombe，V.，Cool，SM and Hinkley，SF（2016）。确定肝素裂解酶治疗后硫酸乙酰肝素解聚的程度。 Carbohydr Polym 152：592-597 。
Carnachan，SM和Hinkley，SFR（2017）。硫酸肝素鉴定和表征：方法I.通过NMR分析的硫酸肝素鉴定。生物样品7（07）：e2196。
Mulloy，B.，Wu，N.，Gyapon-Quast，F.，Lin，L.，Zhang，F.，Pickering，MC，Linhardt，RJ，Feizi，T.and Chai，W。（2016）在市售的制剂中鉴定的游离氨基葡萄糖残留异常高猪肝素硫酸乙酰肝素。分析化学 88（13）：6648-6652。
Skidmore，MA，Guimond，SE，Dumax-Vorzet，AF，Atrih，A.，Yates，EA和Turnbull，JE（2006）。硫酸肝素二糖的高灵敏度分离和检测。 Chromatogr A 1135（1）：52-56 。
Skidmore，MA，Guimond，SE，Dumax-Vorzet，AF，Yates，EA和Turnbull，JE（2010）。源自猪肠肝素抗凝血酶III结合位点的细菌裂解酶四糖的结构研究。 J Biol Chem 268（7）：4780-4787。