材料和试剂

96孔板，U底（Fisher Scientific，目录号：12-565-500）
发光计96孔板（Promega，目录号：Z3291）
2ml Eppendorf管（Fisher Scientific，目录号：05-402-7）
1 ml注射器（BD，目录号：309659）
20 G（0.9 x 25 mm）针（BD，目录号：305175）
表达荧光素酶的转基因小鼠，例如FVB-Tg（CAG-luc，-GFP）L2G85Chco/J小鼠（THE JACKSON LABORATORIES，目录号：008450）
生物样品如小鼠血浆/血清或器官匀浆/上清液（见注释）
DPPIV-Glo ^{TM蛋白酶测定（Promega，目录号：G8351）}
1x PBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM目录号：14190144）
重组人DPP4（R& D Systems，目录号：1180-SE-010）
Prionex（Sigma-Aldrich，目录号：G0411）
DPP4抑制剂（例如K579，Sigma-Aldrich，目录号：D3572）
乙醇

设备

发光计，带读板器（如Promega，型号：GloMax 96微孔板发光计）
多通道移液器
XENOGEN（PerkinElmer，型号：IVIS系统）
精密秤（如Veritas Analytical Balance，AFFORDABLE SCALES AND BALANCES，型号：M124A）
无菌不锈钢珠5毫米（QIAGEN，目录号：69989）
TissueLyser II（QIAGEN，目录号：85300）
台式微量离心机（如Eppendorf，型号：5417 R）

程序

在体外测量DPP4活性
1. 如Promega（我们的测定中使用的DPP4酶活性试剂盒的提供者）所述进行测量DPP4酶活性的方案。简而言之，该测定提供了与二肽基肽酶（DPP）和荧光素酶反应时产生发光信号的DPP4敏感性底物（Gly-Pro-氨基荧光素）。 DPP介导的Gly-Pro二肽的截短对于该反应是必需的，因此发光信号指示DPP酶活性。重要的考虑事项涉及这些测定中使用的生物样品的制备和稀释：
  1. 应在Prionex溶液中以1〜20稀释使用小鼠血清和血浆样品
  2. 小鼠肿瘤匀浆应在Prionex溶液中以1至2和1至10稀释使用。
    注意：有关如何获得肿瘤匀浆物的说明，请参阅协议末尾的说明。
  3. 应在Prionex溶液中以1-2稀释使用腹膜洗液（用1ml无菌冷PBS收集）。
  4. 应使用Prionex溶液中重组人DPP4的稀释液进行标准曲线。以50ng/ml开始，进行2倍稀释至0.01ng/ml
  5. 仅使用Prionex溶液留出2孔（空白孔），以确定测定的背景值。
  注意：我们建议在96孔U形底板中进行稀释，然后将其转移到发光计板中。准备至少60μl的最终体积的样品，以便将50μl每个样品正确吸取到光度计板上。样品转移应使用多通道移液管进行，避免产生气泡。当所有样品已经转移时，使用多通道移液管将50μl反应缓冲液（试剂盒中提供）加入每个孔中。上下移动是不必要的。在光度计读取结果之前，在室温下孵育板15分钟，暴露于室内光线（不要用遮光箔覆盖板）。
2. 准备肿瘤裂解物以分析DPP4活性
3. 收集腹膜洗液用于分析DPP4活性
在体内测量DPP活动
用于测量体外DPP活性的荧光素/荧光素酶系统也可用于检测体内DPP活性，如下所示：
1. 将50μl10nM Gly-Pro-氨基荧光素（由Promega试剂盒提供）注入到表达荧光素酶的小鼠中，例如FVB-Tg（CAG-luc）小鼠。注射可以静脉内或腹膜内。静脉注射导致快速全身递送（5分钟内，参见图1），而腹膜内注射导致在腹膜腔区域中检测到的发光（Barreira da Silva等人，2015）。 >
  
  图1.用对照食物或含有DPP4抑制剂（DPP4i）的食物处理的FVB CAG-萤光素酶转基因小鼠的发光图像的实施例。小鼠喂食过夜各自的饮食。 DPP4i食物是西他列汀1.1％。静脉内注射Gly-Pro-氨基荧光素，注射后3分钟摄取图像。展览时间为1秒。选择感兴趣区域（ROI）用于定量辐射度，以每秒每光子每平方厘米（选择的面积）计算，每个球状体（秒^-1 cm ^-2 sr ^-1）。
2. 将鼠标置于XENOGEN（IVIS系统）中，注射后3-5分钟进行成像发光。在整个手术过程中，应按照每个研究机构规定的异氟烷麻醉系统麻醉小鼠。对于图像采集，测试不同的曝光时间（从1秒开始，最长1分钟）。

数据分析

重要的是要记住，该测定法检测DPP4的活性，但DPP家族的其他成员也可能截短Gly-Pro-氨基荧光素。在小鼠血清或血浆样品中，通过比较来自野生型和dpp4小鼠的样品评估，所测量的DPP活性的至少95％对应于DPP4。每当评估DPP4在其他生物样品（例如肿瘤裂解物）中的具体贡献时，我们建议一式两份测定样品，并将DPP4抑制剂（如K579）添加到两个样品之一中。这种额外控制的原因在于还有其他DPP家族成员（如成纤维细胞激活蛋白[FAP]和细胞内DPP8和9），可能在组织裂解后暴露，在测定中给出阳性信号。 K579以50nM的浓度抑制DPP4的活性。样品不需要长时间与K579一起孵育，因为一旦将试剂混合在一起就会发生这些浓度的抑制。建议使用至少4个生物重复（例如，4只小鼠的生物样品）和每个样品2次技术重复进行测定。
通过将空白孔的RFU水平减去所有值，可以在相对荧光单位（RFU）中进行结果表示。为了表达DPP4特异性活性，可以减少用K579孵育的样品的活性。或者，结果可以以DPP活性的单位表示。为此，请参考用于产生标准曲线的重组DPP4的批号，因为应该说明每重量酶的活性单位。然后可以从测定的标准曲线推断值。
在静脉注射Gly-Pro-氨基荧光素后，可以检测小鼠全身中的DPP4活性。在施用DPP4抑制剂如西他列汀后，该方法可用于研究体内DPP4抑制的药效学（图1）。此外，这种技术可能被外推以测量限制性组织中的DPP4活性，例如接种的荧光素酶表达肿瘤或转移的免疫细胞。建议在至少3次生物复制中进行检测。

食谱

Prionex溶液 - 为每个实验准备新鲜
1x PBS补充0.1％Prionex

致谢

当使用这个协议时，请引用Barreira da Silva等人。（2015）。资助由巴斯德·鲁夫博士后研究金（RBdS），Ligue Contre le癌症以及法国政府的ARC pour la recherche sur le cancer（MLA）和法国政府的"未来计划投资计划"提供，由国民政府管理la Recherche（LabEx Immuno-Onco [RBdS，MAI MLA]）。我们感谢提供FVB CAG荧光素酶转基因小鼠的M.A.Nicola（Plateforme d'imagerie dynamique，Institut Pasteur，Paris，France）。动物实验方案由巴黎的动物实验委员会（动物实验伦理委员会）批准。

参考文献

Barreira da Silva，R.，Laird，ME，Yatim，N.，Fiette，L.，Ingersoll，MA和Albert，ML（2015）。二肽基肽酶4抑制增强淋巴细胞运输，改善天然存在的肿瘤免疫和免疫治疗。 Nat Immunol 16 （8）：850-858。