材料和试剂

离心管14ml（Corning，Falcon ^{®，目录号：352059）}
1.5 ml Eppendorf Snap-Cap微量离心管（VWR，目录号：21008-959）
4毫升螺旋颈瓶，琥珀色玻璃（VWR，目录号：548-0052）
透明的96孔（平底）组织培养板（Corning，Falcon ^{，目录号：353072）}
组织培养瓶，150cm 2（TPP，目录号：90856）
移液头（10μl，100μl，1,000μl）
一次性血清移液管（5ml，10ml和25ml）
试剂储存器，25 ml（Biotix，目录号：SR-0025-5SWM）
具有SFCA膜的Nalgene快速无菌一次性过滤器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：156-4020）}
Hela Rh细胞系（Hela亚克隆，高度易感和允许使用鼻病毒诱导的CPE，来自比利时的Janssen Pharmaceutica的礼物）（Lacroix等人，2014年）
所有EV-68菌株均在HeLa Rh细胞上培养，储存于-80°C
1. 从荷兰分离出EV-D68菌株（742,947,2042,1348,2284和670）（Adam Meijer的一种礼物，国家公共卫生和环境研究所的诊断与筛选[RIVM]，Bilthoven） />
2. EV-D68菌株（US/KY/14-18953，US/IL/14-18952和US/MO14-18947） - 这些菌株最初获自BEI Resources
注意：所有病毒株的裂解物用于抗病毒测定，通过终点滴定测定法测定病毒滴度。
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS），不含钙，无镁（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190144）}
0.05％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25300054）}
最低必需培养基（MEM）Rega-3（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：19993013）
潜在的抗病毒化合物
1. SG85 *
2. Pleconaril *
3. Vapendavir *
4. 皮罗达维尔*
5. Rupintrivir *
6. Enviroxime *
7. 法维西亚*
注意：所有*化合物以10mg/ml的浓度溶解在DMSO中，并在4或-20℃下储存在螺旋瓶中。
胎牛血清（GE Healthcare，Hyclone ^{TM，目录号：SH30084.03）}
L-谷氨酰胺200mM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25030081）}
碳酸氢钠7.5％溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25080060）}
最低必需培养基（MEM），无谷氨酰胺，无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：51200038）}
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
CellTiter 96 AQueous MTS试剂粉末（Promega，目录号：G1111）
HCl
二甲基亚砜（VWR，目录号：67-68-5）
生长培养基（见食谱）
测定培养基（参见食谱）
MTS/PMS解决方案（见配方）

设备

移液器控制器，PIPETBOY acu2（VWR，目录号：612-0927）
多通道移液管，10-100μl（Eppendorf）
37℃（和35℃）和5％CO 2（粘结剂）的培养箱
中型台式离心机（Sigma Laborzentrifugen，模式：4K15C）
Moxi ^TM Z迷你自动细胞计数器（ORFLO Technologies，目录号：MXZ001）
SpectraMax 190酶标仪（Molecular Devices，型号：SpectraMax 190）
pH仪表（Xylem Analytics，WTW，型号：inoLab 9310 IDS）
倒置显微镜（Motic，型号：AE21）
安全柜（Telstar）

软件

GraphPad Prism

程序

在37℃和5％CO 2下，生长Hela Rh细胞在生长培养基（见食谱）中汇合。
注意：Hela Rh细胞在10分钟内传播1次，3-4天后会汇合。
吸出上清液，用10ml PBS洗涤细胞三次，用37℃的胰蛋白酶将细胞分离3-5分钟。
当细胞分离时，用10ml生长培养基在14ml管中收集细胞。在室温下以269×g离心细胞6分钟。
将细胞沉淀重新悬浮在10ml测定培养基中（参见食谱）。
计数单元格数。将细胞以每孔100μl测定培养基以15,000个细胞的密度将细胞种植到96孔板中。在培养箱中37℃和5％CO 2孵育细胞24小时，以使细胞粘附在板上。
将化合物稀释至测定培养基中所需的起始浓度。该起始浓度应为所需的最终浓度的6倍以准备1对3连续稀释。在第二列中加入50μl的6x化合物稀释液至100μl测定培养基中，加入接种细胞的孔B2至G2（最多6个化合物，图1）。

图1.用于抗病毒测定的96孔板的布局。灰井仅含有培养基; VC：病毒控制，CC：细胞控制。
通过温和移液混合第2列培养基，并将50μl培养基从该柱转移到下一列3（B3-G3）（参见图2A）;重复第9列（B9-G9）。从第9列弃去50μl培养基。第10列（B10-G10）将是病毒对照（VC，测定培养基+ EV68），第11列（B11-G11）将是细胞对照（CC，仅测定培养基）。
将100μl所需稀释度的EV68（MOI = 0.001）添加到第2-10列和100μl测定培养基至第11列（参见图2B）。 96孔板边缘的孔（见图1，标记为灰色）含有200μl培养基，但不会使用，因为边缘效应可能会影响测定结果。

图2.工作流程。 A.在处理和感染的孔中轻轻混合测定培养基。将50μl培养基转移到下一个孔，以制备1-in-3稀释系列。 B.制备复合稀释液后，加入100μl含有2x病毒稀释液的测定培养基。
将96孔板置于培养箱（35℃，5％CO2和95％相对湿度）中3-4天，直到通过VC孔中的显微镜观察到完全病毒诱导的细胞病变效应（CPE）（见图3 ）。

图3.细胞对照孔（A）和病毒对照孔（B）中的HeLa Rh细胞。比例尺= 35μm。
取出第2-11列中所有孔的测定培养基，并加入100μl5％MTS/PMS稀释于酚红和无谷氨酰胺培养基中。
在37℃5％CO 2培养箱中孵育40-60分钟后，用波长498nm的酶标仪测量96孔板的每个孔中的吸光度。 />

数据分析

抗病毒活性计算如下：
％抗病毒活性=（OD EV68 +化合物 VC ）/（OD CC -
哪里，
OD< CC>和OD< VC>分别表示细胞对照（第11列）和病毒对照（第10栏）的光密度（OD）的平均值， > OD EV68 +化合物对应于每个感染和处理良好的OD值
计算每种化合物的EC 50值，其定义为病毒诱导的CPE降低50％的化合物浓度。通过GraphPad Prism生成的曲线拟合来计算抗病毒活性的这个值注意：或者，如果GraphPad Prism不可用，也可以使用对数插值来估计EC 50值。下面的代表数据由对数插值显示。

代表数据

％计算每种浓度的抗病毒活性，如下所示：

SG85（μM）	0.0002	0.0005	0.002	0.005	0.014	0.043	0.13	0.38
％抗病毒活动	2.35	5.32	13.85	91.50	98.86	93.33	101.78	104.03

EC ₅₀ = 10 ^{（（Log（ A ） - Log（ B ））x（（ C - 50）/（ C - D ））+日志（ B ））} /> 哪里，
A ：％抗病毒活性的化合物浓度< 50％
B ：％抗病毒活性的化合物浓度> 50％
C ：％antiviral activity的值> 50％
D ：％antiviral activity< 50％

蛋白酶抑制剂SG85对不同EV68临床分离株的抗病毒活性的剂量 - 反应曲线的实例（参见图4）。 EC50值出现在Sun等人的中。（2015）

图4.在具有MTS/PMS读数的CPE降低测定中测定SG85对EV68临床分离物的抗病毒活性

笔记

根据抗病毒测定中使用的细胞类型，每孔的细胞数量可能需要优化。细胞对照组中的细胞在3或4天后不会过度生长，这一点很重要
使用最低的病毒接种，在感染后第3天或第4天在所有孔中仍然产生100％的完全CPE。
如果化合物的1 - 2连续稀释是优选的，则制备4x浓缩的化合物稀释液，并将100μl该化合物稀释液加入第2列;然后从井中转移100μl，以产生1:2稀释系列。
由于其最佳生长温度低，所以EV-D68在35℃下很好地传播
MTS稀释液的孵育时间取决于细胞类型和细胞密度。在添加MTS溶液后，细胞应留在培养箱中，直到CC孔（B11-G11）中出现褐色。 CC的OD值应在0.6和1之间，保持在线性范围内。 Hela Rh细胞在37℃下的孵育时间约为40-60分钟
棕色甲an制品的吸光度值在波长498 nm处可达到最大值。
一般来说，该测定/方法适用于其他微小核糖核酸病毒，具有少量考虑（例如，细胞类型，培养基和温度）。

食谱

生长培养基
MEM补充：
10％胎牛血清
2mM L-谷氨酰胺
0.075％碳酸氢钠
测定培养基
MEM补充：
2％胎牛血清
2mM L-谷氨酰胺
0.075％碳酸氢钠
30mM MgCl 2
MTS/PMS解决方案

将1g MTS粉末溶解于500ml PBS中并搅拌
用1N HCl调节溶液的pH值在6.0-6.5之间
加入23mg PMS粉末直至通过搅拌完全溶解
通过快速流动的无菌一次性过滤器单元过滤溶液
将3ml等分溶液储存在-20℃（应保持在黑暗中以避免降解）

致谢

这项工作得到了中国奖学金委员会（CSC）（授权201403250056）和跨国公司（IUAP）BELVIR的梁孙奖学金的支持。这里描述的协议是基于以下论文：Sun等人。（2015）。

参考文献

Lacroix，C.，Querol-Audi，J.，Roche，M.，Franco，D.，Froeyen，M.，Guerra，P.，Terme，T.，Vanelle，P.，Verdaguer，N.，Neyts，J 。和Leyssen，P.（2014）。一本小说苄腈类似物抑制鼻病毒复制。 J Antimicrob Chemother 69（10）：2723-2732。
Sun，L.，Meijer，A.，Froeyen，M.，Zhang，L.，Thibaut，HJ，Baggen，J.，George，S.，Vernachio，J.，van Kuppeveld，FJ，Leyssen，P.，Hilgenfeld ，R.，Neyts，J.and Delang，L。（2015）。针对肠道病毒D68临床分离株的广谱和肠道病毒特异性抑制剂的抗病毒活性。抗微生物剂Chemother 59（12）：7782-7785。