材料和试剂

Stericup-GP0.22μm聚醚砜500ml无菌灭菌真空过滤瓶（EMD Millipore，目录号：SCGPU05RE）
离心管：
15毫升（康宁，目录号：430790）
50毫升（康宁，目录号：430828）
无菌一次性血清学移液管：
2 ml（Corning，Falcon ^®，目录号：357558）
5 ml（Corning，Falcon ^®，目录号：357543）
10 ml（Corning，Falcon ^®，目录号：357551）
25 ml（Corning，Falcon ^®，目录号：357525）
50ml（Corning，Falcon ^®，目录号：357550）
Nunc ^{TM直径15cm，145cm 2培养区细胞培养/培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：168381 ）}}
Fisherbrand ^TM高级微量离心管：1.5ml（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
低温小瓶1.2ml（Corning，目录号：430487）
TipOne RPT 10μl超低保留过滤器吸头，无菌（USA Scientific，目录号：1181-3810）
ART ^TM阻隔移液管100μl提示100E低保留率（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：2065E-05）}
从脂肪抽吸获得的人体脂肪组织
1x磷酸缓冲盐水（PBS）（GE Healthcare，HyClone ^{TM，目录号：SH30256）}
台盼蓝溶液，0.4％（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15250061）}
溴化乙锭
吖啶橙
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200072）}
异丙醇95％（v/v）
液氮
I型胶原酶（Worthington Biochemical，目录号：LS004196）
牛血清白蛋白（BSA），级分V（Sigma-Aldrich，目录号：10735078001）
氯化钙（CaCl 2），≥96.0％无水（Sigma-Aldrich，目录号：C4901）
Dulbecco改性Eagle培养基（DMEM）：营养混合物F-12（DMEM/F-12）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11330032）}
α-最小必需培养基（α-MEM），无核苷（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：12561056）}
胎牛血清（FBS），高级选择（Atlanta Biologicals，目录号：S11550）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
L-谷氨酰胺（200mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25030081）}
DMSO
消化溶液（参见食谱）
再悬浮液（参见食谱）
完全培养基（CCM）（见食谱）
冷冻介质（参见食谱）

设备

精准量表
Isotemp ^{TM数字控制水浴（Fisher Scientific，型号：215）}
无菌细胞培养罩
电动吸管辅助装置
微量移液器：10μl，200μl和1,000μl（Eppendorf，型号：Research plus）
离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
细胞培养箱
倒置常规光学显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse TS100）
血细胞计数器
冷藏容器（Sigma-Aldrich，目录号：C1562）
Nalgene
低温储存杜瓦瓶（Custom BioGenic Systems，型号：6001加值冷冻系统杜瓦）

程序

ASC隔离（图1）

图1. ASC分离过程的示意图。将Lipoaspirate分离成50ml锥形管，抽吸血液，用PBS洗涤，与消化液一起温育，消化溶液中和，离心。将管离心后，弃去上清液，洗涤SVF至白色。然后重新悬浮SVF，计数细胞，然后铺板在细胞培养板上

温水浴至37°C

从无菌样品收集容器中的手术室收集脂肪抽吸物。吸脂样品通常在操作区域直接排入真空容器。这些容器是无菌的，可以安全地运送到可以发生细胞隔离的实验室。将Lipoaspirate保持在室温，直至准备好分离细胞，并在转移到组织培养罩时保持无菌条件。

准备消化液（参见食谱1）。用无菌条件下用真空过滤器过滤溶液。

准备再悬浮液（参见配方2）。使用真空过滤器在无菌条件下过滤溶液。将再悬浮溶液置于37°C水浴中。

温热消解溶液和PBS中的水浴至37°C

将lipoaspirate和制备的溶液置于无菌细胞培养罩中，并在无菌条件下进行以下步骤

通过在每个管中放置约15ml的lipoaspirate将lipoaspirate分离成无菌的50ml离心管。允许lipoaspirate分离成血液和脂肪层。脂肪层将浮在管的顶部，血液层将在其下面（见图1）。

用吸液管穿透脂肪层，并使用2 ml吸液管抽吸血液层。避免吸入脂肪层，因为这会堵塞吸液管（见图1）。

用PBS清洗脂肪层，直到lipoaspirate为浅黄红色。所需的PBS体积将根据Lipoaspirate样品中存在多少血液而变化。所需的PBS体积范围为5至20ml，并且需要多次洗涤，直到洗涤液清洁。在室温下将溶液以300g离心5分钟，以从脂肪层分离洗涤液。

吸出脂肪层下方的PBS洗液，并避免吸出离心管底部的脂肪层和细胞团块（见图1）。

将Lipoaspirate在相当于初始量的Lipoaspirate（15ml）的消化液体积中孵育60分钟，37℃。例如，15ml的脂肪酸酯应该在15ml消化溶液中孵育。通过大量摇动管子将管混合1分钟，并在整个消化时间内每隔5至10分钟间歇地混合管子。

通过向所使用的消化溶液中加入等量的再悬浮溶液中和胶原酶。例如，在15ml消化溶液中孵育的15ml Lipoaspirate应该被15ml的再悬浮溶液中和。

将溶液在室温下以300×g离心5分钟。该步骤分离浮游脂肪细胞，油脂，脂肪，胶原酶溶液和SVF

弃去上清液，留下约5ml溶液和SVF细胞沉淀。将SVF细胞沉淀重悬于10ml PBS中

重复步骤A12和A13两次，直到颗粒显示为白色。这些洗涤液可以清除红细胞和其他非粘附细胞，而不会影响到ASCs的产量

将SVF重悬于5ml的悬浮液中。将10μl细胞吸入1.5 ml微量离心管中

加入10μl台盼蓝。通过上下移动3-5次将溶液与细胞混合。

将10μl混合的台盼蓝细胞溶液加入血细胞计数器。计数四个外象限的细胞。

作为台盼蓝的替代品，将1μl的100μg/ml溴化乙锭和100μg/ml吖啶橙的1:1溶液与25μl细胞混合。加入10μl混合物到血细胞计数器。在荧光显微镜下计数细胞。

使用以下等式确定每毫升的细胞总数和总细胞数：

哪里，
'2'表示稀释因子，
'10 000'代表血细胞计数器常数。

将细胞在145cm 2培养皿上以100个细胞/cm 2的密度在20ml CCM（每145cm 2约14,500个细胞中） sup>培养皿）。预期的细胞产量范围为每毫升吸脂组织的1.6×10 5至1.1×10 6细胞。

将细胞在37℃的湿润5％CO 2培养箱中保持24-72小时。由于供体的变异性预期与人类样品一起，初始孵化时间的变化与不同供体细胞粘附在板上的速率差异相关。

24-72小时后，用PBS轻轻洗涤细胞层以除去非贴壁细胞，留下板上贴壁的ASC。

吸出并丢弃PBS洗涤。

在PBS吸入后，用CCM替换培养基（145至20ml，145cm ²板）。每2至3天更换一次CCM培养基，直至细胞达到70-80％汇合。融合时间取决于细胞的增殖率。可以预期在4至10天内达到80％的汇合，每2-3天更换一次。一旦发生了足够的增殖，细胞应该被传代（见程序B）或冷冻保存（见程序C）。

在光学显微镜下观察细胞以检查是否存在浮游细胞。浮游细胞的存在表明不良依从性和细胞死亡。

继续在37℃的潮湿5％CO 2培养箱中将细胞维持24-72小时。
扩展ASCs
1. 在光学显微镜下观察细胞（见图2）。细胞在扩张时约为80％汇合。这种汇合水平是最佳的，因为它可以防止当ASC过度生长时发生的细胞因子表达的变化
  
  图2.在4x和10x放大倍数下通过（p）0和p4ASCs的光学显微镜。通过其纺锤形形态鉴定ASCs。比例尺=100μm
2. 在37℃水浴中加热0.25％胰蛋白酶-EDTA，培养基和PBS。
3. 从细胞培养板吸出CCM。
4. 用10ml PBS洗涤细胞并吸出洗液。
5. 加入2-5毫升0.25％胰蛋白酶至145厘米2平板，以充分覆盖整个区域。
6. 将145厘米2厘米的板放置在37℃的培养箱中至少5分钟，不超过20分钟，因为细胞将开始提升到溶液中。
7. 在光学显微镜下可视化细胞以确定酶反应是否完整并且细胞已经提升。通过加入等量的CCM中和胰蛋白酶。反应不应超过10分钟，如果10分钟过去，应中和，以防止细胞膜的降解。
8. 将细胞溶液吸入无菌的50ml锥形离心管中，并在室温下以300×g旋转5分钟。
9. 吸出上清液，留下细胞沉淀。
10. 将细胞沉淀重悬于CCM。
11. 密度为100个细胞/cm 2的平板细胞
ASC的冷冻保存
1. 取出冷冻容器的小瓶隔间，并确保冷冻容器中装满异丙醇至适当的体积
2. 准备冷冻介质（参见配方4）。
3. 吸出培养基，用10ml PBS洗涤，并吸出PBS。 PBS洗涤残留的血清，抑制胰蛋白酶。
4. 加入2-5毫升0.25％胰蛋白酶至145厘米2平板，以充分覆盖整个区域。
5. 将细胞置于37℃的细胞培养箱中5分钟
6. 在光学显微镜下可视化细胞以确定酶反应是否完整并且细胞已经升高。通过加入等量的CCM中和胰蛋白酶。反应不应超过10分钟，如果10分钟过去，应该中和。
7. 在室温下离心300×g 5分钟。
8. 重悬于1ml PBS中。使用如上所述的血细胞计数器计数细胞。
9. 在室温下离心300×g 5分钟。
10. 吸出上清液并将细胞在冷冻介质中重新悬浮至约1×10 6细胞/ml。
11. 将1ml细胞悬液吸入干净的1.2ml低温小瓶中。使用该体积的细胞悬浮液，每个低温小瓶将具有约1×10 6个冷冻细胞。标签样品瓶，具有适当的样品标题和冻结日期。一旦细胞处于冷冻介质中，在5分钟内将小瓶移至-80°C冰箱。在室温下延长暴露于DMSO可导致细胞活力降低。
12. 将小瓶放入酒精夹套的冷冻容器中。酒精夹套容器将冷却速度降低至约-1℃/min，这是细胞保存的理想冷却速度。
13. 将酒精夹套冷冻容器放入-80°C冰箱。
14. 一旦细胞进入冷冻箱24小时，就可以将其移入液氮

数据分析

有关代表性照片和结果，请参阅Estes 等人。（2010）。

笔记

使用下部通道的细胞导致更好的再现性。因此，我们建议在所有实验的2-6段之间使用ASC。通道1细胞代表分离后冷冻的ASCs的初始种群。
在使用前一天或之前准备所有解决方案以获得最佳效果。
细胞分离应在同一天进行来自患者的组织收获以获得最高的生存能力，尽管我们组还确定了>收集后长达24小时，可以从组织中回收90％的贴壁ASC
所有lipoaspirate样品必须根据机构审查委员会关于人体组织收集的政策获得。这些方案包括患者的知情同意和组织操作，只有那些受过培训才能与血液传播的病原体合作的人。

食谱

消化液
100毫升PBS
0.1 g胶原酶I
1克BSA原料
200μl200mM CaCl 2
轻轻摇动管，直至溶液均匀，CaCl 2完全溶解
无菌过滤器即将使用前
重悬液
900毫升DMEM/F-12
100毫升FBS
完全培养基（CCM）（1000ml）
780 mlα-MEM
200毫升FBS
10 ml 100x L-谷氨酰胺
10 ml青霉素 - 链霉素10,000 U/ml
冷冻培养基（100 ml）
65mlα-MEM
30毫升FBS
5毫升DMSO
在无菌过滤器单元中过滤
注意：将DMSO加入到培养基中，然后加入血清进行冷却。确保使用DMSO安全过滤器。一旦解冻，请丢弃任何未使用的介质。

致谢

该协议是Strong 等人中列出的协议的扩展。（2016）。作者要感谢Marjorie McCants协助组织材料和设备，Stephen Dickinson，Annie Bowles和Rachel Sabol帮助创建了这些数字。马克思是LaCell，LLC的联合创始人和共同所有者。所有其他作者都表示没有利益冲突。

参考文献

Aust，L.，Devlin，B.，Foster，SJ，Halvorsen，YD，Hicok，K.，du Laney，T.，Sen，A.，Willingmyre，GD and Gimble，JM（2004）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14985162"target ="_ blank">来自吸脂抽吸物的人类脂肪来源的成体干细胞的产量。细胞疗法 6（1）：7-14。
Estes，BT，Diekman，BO，Gimble，JM和Guilak，F。（2010）。分离脂肪来源的干细胞及其对软骨形成表型的诱导。 Nat Protoc 5（7）：1294-1311。
Gimble，J。和Guilak，F。（2003）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14578098"target ="_ blank" >脂肪来源的成体干细胞：分离，表征和分化潜能。细胞疗法 5（5）：362-369。
Strong，AL，Bowles，AC，Wise，RM，Morand，JP，Dutreil，MF，Gimble，JM and Bunnell，BA（2016）。