材料和试剂

巴斯德移液器（VWR，目录号：6121701）
Eppendorf管1.5ml（Sigma-Aldrich，目录号：T9661）
Pertri菜（Greiner Bio一，目录号：633185）
50ml锥形管（Corning，Falcon ^®，目录号：352070）
15ml锥形管（Corning，Falcon ^®，目录号：352196）
14ml聚苯乙烯圆底管（Corning，Falcon ^®，目录号：352051）
Miracloth（EMD Millipore，目录号码：475855）
注射器25毫升（Terumo，目录号：SS-20ES）
Acrodisc ^®针筒过滤器（Pall，目录号：4187）
铝箔（Fisher Scientific，目录号：01213102）
大肠杆菌菌株OP50
秀丽隐杆线虫菌株N2
受精菌株ATCC 96282
接种菌株D.rerechmeria coniospora
pLH4237质粒DNA含有由D驱动的潮霉素B磷酸转移酶:: GFP嵌合基因。球孢子β微管蛋白启动子（β-tub）:: HPH :: GFP，Lebrigand等人，2016）
氨苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）
庆大霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G1272）
潮霉素B（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10687010）
二 - 正磷酸氢钾，K 2 HPO 4（VWR，目录号：26931.263）
磷酸二氢钾，KH 2 PO 4（VWR，目录号：0781-1KG）
Bacto琼脂（BD，Bacto，目录号：214010）
Bacto蛋白胨（BD，Bacto，目录号：211677）
氯化钠，NaCl（VWR，目录号：27810.295）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C3045）
乙醇（VWR，目录号：20821.321）
硫酸镁，MgSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
氯化钙，CaCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
酵母提取物（Douchefa Biochemie，目录号：Y1333）
D-山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S3889）
Aurintricarboxylic acid，ATA（EMD Millipore，目录号：189400）
Tris/HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T6666）
聚乙二醇（PEG 3350）（Sigma-Aldrich，目录号：P4338）
Caylase C4（CAYLA，目录号：caseC4-5）替代可以是裂解酶（Sigma-Aldrich，目录号：L1412）
注意：caseC4-5的超链接不再可用。替代方案可能是裂解酶，我们仍然在实验室中测试其效率。
磷酸盐缓冲液（见配方）
中等（见配方）

NGM-AG
NGMY
NGMY液体
NGMS

15 mM ATA溶液（见配方）
50 mM NaCl溶液（参见食谱）
CaCl 2 <1700>（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
STC 1700（见食谱）
PEG 1700（见食谱）

设备

立体显微镜（Leica Microsystems，型号：MZ16 F）
HERAsafe KS安全柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Herasafe ^{TM KS/II类，目录号：51022751）}}
离心机（Eppendorf，目录号：5810 R）
漏斗
Spatula
插入250毫升玻璃锥形瓶
用于培养瓶的旋转振荡器（Eppendorf，型号：New Brunswick Scientific Innova 4080）
计数室（Burker，Tiefe 0.1000m，0.0025mm ²）
平衡器
Pipetman P1000
高压釜

程序

菌丝体制备
1. 在室温下解冻冷冻真菌菌丝体，并铺展在NGM平板（含氨苄青霉素和庆大霉素）上。在25°C培养1周。使用立体显微镜，确认孢子的外观。如果没有孢子可见，请继续培养并每天检查。
2. 使用弯曲的无菌玻璃巴斯德吸管，轻轻擦拭真菌菌落以驱除孢子。使用1 ml的50 mM NaCl（图1A和1B）从板上清洗孢子，并收集到Eppendorf管中。
3. 将孢子（20-100μl）撒在9cm NGM-AG板上（图1C），并在安全柜中干燥。同时，准备一批同步的L4阶段蠕虫（Stiernagle，2006）。通常，从一个人口稠密的9厘米平板，可以获得4,000-6,000个蠕虫。将每个板上的蠕虫用5ml 50mM NaCl洗涤到15ml Falcon管中，并以721×g离心1分钟;小心地去除上清液，重悬在剩余的溶液中，并将一半混合物铺在9cm NGM-AG板上。蠕虫将被孢子感染。将得到的板在25℃下孵育10天
4. 像步骤A2一样冲洗孢子。准备用OP50种植的4个9cm NGM板（Stiernagle，2006）。将从一个NGM-AG板收集的孢子传播到具有OP50的4个NGM板上。如果需要，让溶液干燥。
  
  图1.感染板的制备 A和B.从NGM-AG板洗涤孢子; C.将孢子溶液撒在NGM OP50板上; D.来自NGM-AG板的孢子，使用Nomarski光学的显微照相。
5. 将L4或年轻成虫N2蠕虫从上述一个9cm板（通常为4,000-6,000个蠕虫）收集到每个孢子-OP50板上，并孵育24-30小时。
6. 将来自每个板的受感染的蠕虫用1.5ml 50mM NaCl洗涤到15ml Falcon管中，并以721×g离心1分钟;仔细取出上清液，将蠕虫颗粒重新悬浮并分成三个9cm NGMY板之间。使用弯曲的无菌玻璃巴斯德移液器轻轻地将颗粒散布在板的表面上。如果有必要，在25°C孵育1天后，在安全柜中干燥。这个时候大多数成虫都应该死了（图2）。在死亡之前，他们将产生后代，这时下一代的大部分蠕虫将会活着。
  
  图2. NGMY板上感染的蠕虫。两个死亡的成虫与多个活的幼虫。
7. 向每个平板上加入1-2毫升50毫升的NaCl，并使用弯曲的无菌玻璃巴斯德吸管，擦去重悬死的蠕虫。从15毫升Falcon管中的3个板中收集液体;将溶液转移到250ml NGMY液中，在摇动培养箱中以170rpm培养36-40小时
原创性
1. 将液体培养液倒入带有Miracloth的漏斗中以过滤菌丝体;用100ml CaCl 2 1700缓冲液洗涤，使用刮刀将菌丝体转移到50ml Falcon管中（图3）。将二手漏斗和Miracloth放在无菌环境中供以后使用。
  
  图3.用Miracloth收集菌丝体
2. 在新制备的裂解缓冲液中称重菌丝体并用温和的涡旋重悬;每1克菌丝体中加入10毫升裂解缓冲液。如果体积超过30ml，请使用无菌的布塞锥形烧瓶，否则使用50ml Falcon管。
3. 将菌丝体溶液在30℃下以60rpm孵育1-1.5小时。 1小时后，定期取出小分，并在显微镜下检查溶液。菌丝体片段对潮霉素的选择具有相当的抗性，可以产生菌落;尽可能避免碎片化。如果出现短的菌丝体碎片（图4），请转到下一步骤停止孵化。
  
  图4.裂解缓冲液消化前后的菌丝体溶液。 A.处理前的菌落; B.殖民地1小时后处理，用原生质体（红色箭头）; C.处理后的菌丝体碎片（黑色箭头）。 A和B中刻度棒=20μm;比例尺= 50μm
4. 将漏斗与原生质体步骤1中使用的Miracloth一起放入50ml Falcon管中。在裂解缓冲液中过滤菌丝体和原生质体，保留滤液
5. 将相同体积的冰冷STC缓冲液加入到原生质体溶液中，轻轻混合并在冰上离开10分钟。
6. 将混合物在4℃，1,127×g离心15分钟
7. 仔细丢弃上清液;首先用移液管用1ml冰冷的STC缓冲液缓缓沉淀，再加入24ml冷STC缓冲液至原生质体中;将混合物在4℃，1,623×g离心10分钟
8. 再次重复步骤B7。
9. 弃去上清液，加入300μl冰冷的STC缓冲液重悬原生质体;使用血细胞计数器去除小等分试样并计数原生质体（图5）。使用冰冷的STC缓冲液将原生质体稀释至最终浓度为108个原生质体/ml。然后，将溶液储存在冰上或4℃;它可以用于转换最多7天。
  
  图5.血细胞计数器上的原生质体。个体原生质体用红色箭头表示。
转型
1. 加入1μlATA到圆底14ml Falcon管的壁上，与10μg或更多的质粒DNA（体积约10μl）混合，然后轻轻移液与150μl原生质体溶液混合;在室温下孵育混合物40分钟。
2. 使用Pipetman P1000，加入6滴PEG1700缓冲液，轻轻混匀;再加入850μlPEG缓冲液，轻轻摇匀，再孵育20分钟
3. 加入10ml室温STC缓冲液;在室温下以1,623×g离心10分钟。
4. 仔细丢弃上清液;在室温下用300μlSTC重悬原生质体
5. 加入150μl原生质体溶液至9 cm平板（见注2），用无菌弯曲玻璃巴斯德吸管轻轻涂抹;在25℃培养3周。
6. 当使用包含荧光报告基因的转化构建体时，通过PCR或荧光立体显微镜检查任何菌落是否成功转化。

笔记

除非另有说明，温度始终为25°C
除了OP50 NGM板，所有其他板均为氨苄青霉素和庆大霉素。当转化构建体包含潮霉素抗性盒时，NGMS板补充有25μg/ml潮霉素。
高压灭菌后，将铝合金袋（折叠两次）放入带有切割角的铝箔袋中，以免冷凝不积聚，布料干燥（图6）。

图6. Miracloth准备

食谱

1M磷酸盐缓冲液，pH 6.0 108.3g KH 2 PO 4
35.6g K 2 HPO 4
将ddH ₂ O添加到1 L
中等//

1 L NGM
20克琼脂
2.5克蛋白胨
3克NaCl
5毫克/毫升胆固醇在1毫升乙醇中
高压灭菌后，在121℃高压灭菌20分钟后，加入：
1 ml 1 M MgSO 4（灭菌）
1毫升1M CaCl 2（灭菌）
1ml 1M磷酸盐缓冲液pH6.0（灭菌）
NGM-AG
NGM与100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml庆大霉素
NGMY
NGM加酵母提取物20 g/L
NGMY液体
NGMY无琼脂
NGMS
NGM-AG加D-山梨醇

15 mM ATA溶液（高压灭菌器）
在100ml ddH 2 O中的0.634g三羟甲基胺在121℃下高压灭菌20分钟
50 mM NaCl溶液（高压釜）
5.8g NaCl的2L ddH 2 O，并在121℃下高压灭菌20分钟
CaCl 2 1700（500ml，121℃高压灭菌20分钟）
15.0g CaCl 2
17.5克NaCl
裂解缓冲液
CaCl 2 1700：C4 Caylase = 10ml：（或CaCl 2 1700：裂解酶= 10ml：200mg）
注意：每次准备新鲜，用注射器和胶片过滤。
STC 1700（500ml，高压釜）
109.3g山梨醇
5ml Tris/HCl
22.8g CaCl 2
1克NaCl
PEG 1700（100ml，高压釜）
60克PEG 4000
1 ml Tris/HCl
0.74g CaCl 2·2H 2 O ○
注意：以1M pH 7.5,60.6g/500ml，MW = 121.2储存的Tris/HCl溶液。

致谢

我们感谢Eric Record博士协助建立协议，Carole Couillault和Zhang Xing的协助。我们还感谢Nathalie Pujol博士的意见和建议。这项工作得到了ANR（ANR-12-BSV3-0001-01）的计划资助和INSERM，CNRS和AMU的机构资助。他由中国奖学金委员会支持。

参考文献

Lebrigand，K.，Hele，D.，Thakur，N.，Arguel，MJ，Polanowska，J.，Henrissat，B.，Record，E.，Magdelenat，G.，Barbe，V.，Raffaele， Barbry，P.和Ewbank，JJ（2016）。 >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
Ochman，H.，Gerber，AS和Hartl，DL（1988）。反向聚合酶链反应的遗传应用遗传学 120（3）：621-623。
Turgeon，BG，Condon，B.，Liu，J. and Zhang，N。（2010）。丝状真菌的原生质体转化 In：Sharon，A.（Ed。）。真菌的分子和细胞生物学方法。 em a>>>>>：：：：：：：：：：：：
Stiernagle，T。（2006）。维护 C。 elegans 。在： C。线虫研究社区（Ed。）。 WormBook。 WormBook 。