材料和试剂

0.2μm注射器过滤器（Beyotime，目录号：FF252）
稻苗
营养液
Amerlite IR-120B树脂（H ⁺形式）（Alfa Aesar，目录号：L14285）
Dowex 1 x 8树脂（100-200目，甲酸酯形式）
蒸馏水
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
甲酸（HCOOH）（Sigma-Aldrich，目录号：695076）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：223506）
草酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：75688）
苹果酸（Sigma-Aldrich，目录号：M8304）
柠檬酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：251275）
1 N HCl（参见食谱）
2 N HCl（参见食谱）
2 M HCOOH（见配方）
4 N NaOH（参见食谱）
0.5mM CaCl 2（参见食谱）

设备

1.25L黑色塑料罐（塑料罐必须不透明，如果需要，将其包装成黑色胶带）
pH计（Mettler Toledo，型号：S40/SG78/SG23/SG68）
阳离子交换柱（16mm×14cm）（Bio-Rad Laboratories，型号：732-1010）
旋转蒸发器（IKA，型号：RV10）
离子色谱（Thermo Fisher Scientific，Dionex，型号：ICS 3000系统）
IonPac AS11阴离子交换分析柱（4 x 250 mm）
护栏（4 x 50毫米）

程序

培养充分营养液中的水稻幼苗7 d。然后将10只均匀的幼苗移植到1.5升的盆中。 6 d处理后，弃去营养液，用0.5mM CaCl 2（pH5.5）处理这些水稻幼苗过夜，收集有机酸（图1）。

图1.用于收集根系分泌物的装置
12小时后，收集和称重处理的水稻幼苗的新鲜根。将根系渗出物通过含有5g Amerlite IR-120B树脂（H +）的阳离子交换柱（16mm×14cm）渗透到0.5mM CaCl 2 /形式）和填充有1.5g Dowex 1×8树脂（100-200目，甲酸盐形式）（图2）的阴离子交换柱。总的来说，这个过程大约需要5.5小时

图2.保留有机酸的设备
在第二步后立即用15ml 1N HCl洗脱保留在阴离子交换树脂中的有机酸阴离子（图3）。

图3.用于洗脱有机酸的设备
然后，使用40℃旋转蒸发器，120rpm的转速和35hPa的真空压力蒸发洗脱液（图4）。

图4.用于浓缩有机酸的设备
当洗脱液完全干燥成粉末（约30分钟后）时，终止蒸发过程。然后将粉末重新溶解在1ml蒸馏水中，然后通过0.2μm注射器过滤器过滤溶液，然后再分析
通过离子色谱法（ICS 3000; Dionex）检测有机酸阴离子，该离子色谱装备有IonPac AS11阴离子交换分析柱（4×250mm）和保护柱（4×50mm）。流动相为0.6g/min，流速为1.2g/L NaOH。通过使用1,5,10,30,50,80和100 mg/L有机酸（草酸盐，苹果酸盐和柠檬酸盐）储备溶液产生标准曲线。
计算表达其的有机酸流出量与根鲜重的函数。

注意：

有机酸的回收率必须> 80％。为了计算回收率，使用至少两种不同浓度的有机酸（草酸盐，苹果酸盐和柠檬酸盐）储备溶液。例如，将20μl或100μl100 mg/L有机酸储备溶液与1 L蒸馏水混合，重复步骤1至5（蒸馏水中理论浓度为2或10μg/ml）。然后重复步骤6，计算实际有机酸浓度。最后，使用以下公式计算回收率：
恢复率=（实际值/理论值）x 100.
为了制备阴离子交换树脂，在室温下将1L 4N NaOH中的阴离子交换树脂粉末（500g）洗涤约30分钟。重复三次，用蒸馏水冲洗至中性pH值。在1L 2 M甲酸中洗涤三次，每次约30分钟，再用蒸馏水洗至中性pH。
类似地，用0.5L 4N NaOH在60℃下将阳离子交换树脂（500g）洗涤四次约1小时，然后用蒸馏水冲洗至中性pH，然后在0.5℃下洗涤三次L 2 N HCl在室温下每次约1小时，然后用蒸馏水冲洗至中性pH。
所制备的树脂可以在4℃下储存至少1年。
这种方法可以容易地适应其他植物物种，如拟南芥（Zhu et al。，2012）。然而，对于一些小的植物物种，有机酸的分泌是有限的。在这种情况下，回收率可以相对较低，因此必须按比例放大每盆的植物数量以便收集足够的有机酸。

数据分析

通过绘制峰面积与已知浓度来绘制每种有机酸的标准曲线。
使用标准曲线计算每种有机酸的浓度。这将提供洗脱液中存在的有机酸的浓度。数据可以按根鲜重除以确定每克水稻根分泌的有机酸的量。
使用以下公式计算有机酸的浓度：
F = C×V/W
哪里，
F是根中分泌的有机酸（μg/g Fw），
C是有机酸的浓度（mg/L），
V是有机酸的体积（在本研究中为1ml），
W是一盆（g Fw）
的10个水稻根的鲜重以下是苹果酸浓度计算的一个例子。样品面积为0.0612，然后在标准曲线方程y = 0.0084x + 0.0056（图5）中使用，计算出苹果酸盐的浓度为6.6190 mg/L。本研究中苹果酸盐的体积为1ml，根鲜重为0.6126g。然后将所得值用于上述公式计算根中的浓度（10.8048μg/g Fw）。

图5.苹果酸的标准曲线

食谱

1 N HCl
向约500ml蒸馏水中加入〜88ml 37％的HCl，然后用蒸馏水将溶液的最终体积调节至1L。
2 N HCl
向约500ml蒸馏水中加入〜176ml 37％的HCl，然后用蒸馏水将溶液的最终体积调节至1L。
2 M甲酸（HCOOH）
向约500ml蒸馏水中加入〜78.6ml 96％HCOOH，然后使用蒸馏水将溶液的最终体积调节至1L。
4 N NaOH
向蒸馏水中加入166.7g NaOH至1L的最终体积
0.5mM CaCl 2（pH5.5）

0.5M CaCl 2 储备溶液
在蒸馏水中溶解73.505g CaCl 2·2H 2 O，并加入蒸馏水至1L的最终体积
0.5mM CaCl 2
用蒸馏水稀释5ml的0.5M CaCl 2 2储备溶液至最终体积为5升。
用1N HCl将0.5mM CaCl 2溶液的pH调节至5.5

100 mg/L有机酸储备溶液（草酸盐，苹果酸盐和柠檬酸盐）
100毫克草酸盐，苹果酸盐和柠檬酸盐一起
加入蒸馏水至1升，制成100mg/L储液将储备溶液稀释至1,5,10,30,50,80和100mg/L以产生标准曲线

致谢

从Ma等人修改了收集和浓缩有机酸的方法。（2004），有机酸含量的测定由Zhu等人修改。（2015），并在中国科学院沉芳沉土壤科学实验室研究开发。这项工作得到了中国国家重点基础研究计划（2014CB441000），中国自然科学基金（31501825）和中国科学院"战略重点研究计划"（编号XDB15030302和XDB15030202）的支持。

参考文献

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Ma，JF，Nagao，S.，Sato，K.，Ito，H.，Furukawa，J.and Takeda，K。（2004）。负责大麦中柠檬酸激活的Al激活分泌的基因的分子图谱.J Exp Bot 55（401）：1335-1341。
Ma，Z.和Miyasaka，SC（1998）。芋头中的草酸盐渗出物响应于Al。植物生理学118（3）：861-865。
Neumann，G.，Massonneau，A.，Martinoia，E.和Römheld，V.（1999）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://link.springer.com/article/10.1007/s004250050572"target ="_ blank">白羽扇豆类软组织根系发育期间磷缺乏的生理适应性。植物208（3）：373-382。
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