材料和试剂

6孔板
6孔碟
MicroAmp ^®光学96孔反应板（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM）
MicroAmp ^®光学胶带（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM）
SON正常人间质成纤维细胞表达miR-409 miRNA
青霉素 - 链霉素（1％，存量：10,000 U/ml）
外来体消耗的FBS培养基补充（系统生物科学，目录号：EXO-FBS-50A-1）
Exo-Quick-TC（系统生物科学，目录号：EXOTC10A-1）
SeraMir外源体RNA纯化试剂盒（系统生物科学，目录号：RA808A-1）
热灭活的胎牛血清（Bio-Whittaker）
DMEM
F-12K
碳酸氢钠
胰岛素
三碘甲腺原氨酸
转铁蛋白
生物素
Adenine
dNTP混合物（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM）
M_MLV逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM）
10x RT缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM）
RNase抑制剂（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM）
dH 2 O（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM）
用于hsa-miR-409-3p，hsa-miR-409-5p和RNU6B的Taqman miRNA引物组（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM）
Taqman通用PCR主混合物，无AmpErase UNG（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM）
T介质（见配方）
逆转录混合1次反应（见配方）
单次反应的实时PCR反应混合物（参见食谱）

设备

离心机
Nanodrop 2000/2000c分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Nanodrop ^{TM 2000/2000c分光光度计）}}
Applied Biosystems 7500实时PCR机（Thermo Fisher Scientific，型号：7500实时PCR系统）
PCR机器

软件

Taqman软件
Graphpad Prism软件

程序

细胞培养
前列腺正常人间质成纤维细胞，SON稳定转导与miR-409慢病毒颗粒。基质细胞来自患者。在6孔板中以3×10 5个细胞的浓度培养基质细胞，并保持在T培养基中。将基质细胞维持在具有外来体消耗的FBS培养基补充物的T介质中72小时。收集条件培养基，用于提取EV。
exosomes的提取
1. 将来自细胞的条件培养基（CM）离心15分钟。在3,000×g处除去细胞碎片。
2. 使用Exo-Quick-TC用于组织培养基的上清液（5ml）用于提取EV。将Exo-Quick-TC（1ml）与5ml CM混合，将管倒置3次，并在4℃保持过夜。
3. 第二天，溶液以13,000rpm离心2分钟。除去上清液，使用外来体颗粒。
4. 将来自SeraMir外源体RNA纯化试剂盒的裂解缓冲液（350μl）加入到外来体颗粒中并涡旋15秒。将溶液置于室温下5分钟
miRNA提取
根据制造商的说明书，使用SeraMir外源RNA纯化试剂盒从EV中提取miRNA。使用Nanodrop分光光度计测量RNA浓度和纯度
miRNA检测
1. 分别检测hsa-miR-409-5p，hsa-miR-409-3p和RNU6B的MiRNA。将相等量的miRNA（25ng）加入到反应中。按照制造商的说明遵循程序。
2. 逆转录：逆转录混合物如下所述进行（参见食谱）。 RT反应如下：16℃-30分钟，42℃-30分钟，85℃-5分钟。
3. 定量实时PCR（RT-PCR）：如下所述进行RT-PCR反应（参见食谱）。测试以重复的方式运行。将反应混合物放入MicroAmp Optical 96孔反应板中，并用MicroAmp 光学胶带密封。使用Taqman软件，在标准运行速度下，使用10μl的反应体积，在Applied Biosystems 7500实时PCR仪中进行测定。使用C 值来确定相对折叠变化，并将结果归一化为RNU6B。确定来自囊泡部分的差异miRNA表达并绘制在图中。

数据分析

数据分析按照Applied Biosystems手册中的说明进行。实时PCR测定以重复的方式进行。 Taqman软件确定特异性miRNA（例如，miR-409-3p）的C 值。 RNU6B用作内源对照。通过减法确定靶miRNA和RNU6B之间的差异。然后将归一化值（x）计算为2 ^x。值表示为平均值±标准偏差。比较不同的组，并且使用Graphpad Prism软件将miRNA浓度图形化为miRNA的相对变化，使其归因于RNU6B。如果比较2组，则使用Student's -test进行统计分析。如果比较超过2组，则使用单向Anova测试。所有的实验都是以至少两到三次独立的时间重复进行的。

笔记

细胞中的miRNA浓度在胞外囊泡中变化。对于从基质成纤维细胞的条件培养基进行miRNA检测，我们使用稍高的RNA浓度用于逆转录（25ng）。当确定来自条件培养基或体液的EV的低浓度的某些miRNA时，需要更高浓度的RNA来检测感兴趣的miRNA。中试测试需要25 ng至100 ng的浓度。由于不同的miRNA存在于不同的水平，初始剂量反应曲线将有助于确定合适的RNA起始浓度。

食谱

T-medium
DMEM：F-12K，4：1，补充：
5％FBS
3克/升碳酸氢钠
5μg/ml胰岛素 13.6 pg/ml三碘甲状腺原氨酸 5μg/ml转铁蛋白
0.25μg/ml生物素
25μg/ml腺嘌呤
反转录混合1次反应
实时PCR反应混合物，用于单次反应

致谢

这些实验程序已经出版了Josson等人，2015年。这项工作的授权来自P01-CA98912，DAMD-17-03-02-0033，RO1-CA122602（L.W.K.Chung）。

参考文献

Josson，S.，Gururajan，M.，Sung，SY，Hu，P.，Shao，C.，Zhau，HE，Liu，C.，Lichterman，J.，Duan，P.，Li，Q.，Rogatko， A.，Posadas，EM，Haga，CL和Chung，LW（2015）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25065597"基质成纤维细胞衍生的miR-409促进上皮 - 间质转化和前列腺肿瘤发生。 34（21）：2690-2699。
Morello，M.，Minciacchi，VR，de Candia，P.，Yang，J.，Posadas，E.，Kim，H.，Griffiths，D.，Bhowmick，N.，Chung，LW，Gandellini，P.，Freeman ，MR，Demichelis，F.和Di Vizio，D.（2013）。大型癌基因介导功能性微小RNA的细胞间转移。细胞周期 12（22）：3526-3536。