材料和试剂

机构ACUC批准原位同种异体移植协议
面罩，帽子，干净的实验室外套，手臂盖和无菌手套
组织培养瓶
70％酒精擦拭纸（DUKA1，目录号：852）
棉签
30 G½"针（BD，目录号：305106） - 原位植入
反射9毫米不锈钢伤口夹（Roboz手术器械，目录号：RS-9262）
21 G 1"针& 3 ml注射器（BD，目录号：309575） - 肺膨胀
POLYSORB ^TM尺寸3-0 USP（2公制），30英寸（75厘米）在V-20针吸收性外科缝合线上接触（COVIDIEN，目录号：GL322）
Myc-CaP细胞（ATCC，目录号：CRL-3255）
FVB/N雄性小鼠（THE JACKSON LABORATORY），10周龄以上
注意：后短柔毛小鼠具有雄激素信号传导和较大的前列腺，便于移植。我们还建议使用与年龄和体重大致相同的小鼠。男性GEM模型也可以使用，只要它们完全反向FVB/N。
Matrigel（康宁，目录号：354234）
1×磷酸缓冲盐水（PBS），pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10010-023）
1x胰蛋白酶-EDTA（Mediatech，目录号：25-053-CI）
Fluriso异氟烷（VetOne，目录号：501017）
10％聚维酮碘"Betadine"制剂溶液，16盎司（Henry Schein，目录号：6906950）
50mg/ml可注射Carprofen（Zoetis，目录号：07-844-7425）
乙醇，试剂酒精200，PHARMCO-AAPER ^TM（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：16-100-824）
ImmPRESS HRP抗兔聚合物检测试剂盒（Vector Labs，目录号：MP-7401）
ImmPACT DAB过氧化物酶底物（载体实验室，目录号：SK-4105）
Myc-CaP生长培养基（见食谱）

Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11965-092）}
胎牛血清（Gemini Bio-Products，目录号：100-106）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140-122）}
牛垂体提取物（BPE）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：13028-014）}
重组人EGF（R& D Systems，目录号：236-EG）
牛胰岛素粉（Gemini Bio-Products，目录号：700-112）

设备

孵化器
离心机
细胞培养层流罩，真空抽吸，离心机，细胞计数器
2 L感应室
剪刀（Roboz手术器械，目录号：RS-5914）
精镊（Roboz手术器械，目录号：RS-5132）
鼠标房屋和搬运设施
包括蒸发器，感应室，管道，鼻锥和氧气罐的异氟烷气体麻醉系统（VetEquip，目录号：922100）
玻璃珠灭菌器（GERMINATOR 500）（Roboz Surgical Instrument，目录号：DS-401）
充电剃须刀
空间凝胶加热垫（Braintree Scientific，目录号：SPGL）
25μl，702 RN型注射器（Hamilton，目录号：7636-01）
注射器导管25μl-500μl/7000 SYR（Hamilton，目录号：14906）

程序

注意：所有在小鼠中进行的手术必须首先获得ACUC机构的批准

用于注射的Myc-CaP细胞的培养和制备
1. 在具有Myc-CaP生长培养基的组织培养瓶中传播Myc-CaP细胞并按照ATCC指南进行传代。每只小鼠移植1×10 6个Myc-CaP细胞。由于针内的"死空间"，高估了20％或至少两个额外同种异体移植物所需的同种异体移植物数量。
  注意：不推荐每只小鼠注射超过1×10 6个/m 2的Myc-CaP细胞，因为它会加速原发性肿瘤的生长，并缩短由于发病而导致的移植和安乐死之间的时间。这可能会降低观察转移性疾病的可能性。
2. 在收获Myc-CaP细胞注射之前，在冰上解冻Matrigel。
3. 从含有80-90％Myc-CaP细胞汇合单层的培养瓶中取出培养基，用1×PBS洗涤细胞，并在37℃培养箱中，在0.05％胰蛋白酶-EDTA中孵育3-6分钟来分离细胞。通过添加生长培养基中和胰蛋白酶。
4. 将细胞转移到50ml锥形管中，并以300×g离心5分钟。取出胰蛋白酶/培养基，然后将细胞沉淀重新悬浮于新鲜生长培养基中
5. 计数细胞以每个同种异体移植物分离1×10 6个细胞。将分离的细胞悬浮液以300×g离心5分钟。
6. 在冰上执行以下步骤。取出培养基并将基质胶中的细胞沉淀重悬于每1×10 6细胞10μl的体积中。保持细胞：Matrigel混合物在冰上直到植入。
  注意：在植入之前彻底混合细胞：Matrigel。
将Myc-CaP细胞移植到前列腺中> 10周雄性FVB/N小鼠
1. 根据您的机构动物护理和使用委员会（ACUC）指南，使用无菌技术在层流罩中进行移植。在整个程序中佩戴面具，帽子，干净的实验室外套，手臂盖和无菌手套。使用玻璃珠灭菌器灭菌仪器，并在动物之间用70％乙醇消毒。
2. 通过在氧气中吸入2％异氟烷，使用2L诱导室诱导全身麻醉。完全麻醉诱导后，通过鼻锥保持约1.5％异氟烷麻醉，根据需要进行调整，以保持深层麻醉平面（图1）。麻醉水平足以在手指之间捏住皮肤之间的数字不刺激踏板撤退。
3. 根据您的制度准则提供抢先镇痛。
  注意：根据我们制定上认可的动物方案，我们将5毫克/千克卡洛芬的皮下注射到无菌盐水中，总体积为0.5毫升。
4. 将麻醉的老鼠置于背侧卧位，将头发刮到手术部位，用Betadine擦拭手术部位，然后用70％酒精擦拭拭子（图1）。
5. 使用无菌剪刀和细镊子，在横截面上方2厘米长的水平切口（图1和Bertrand等人，2016）。一旦腹壁暴露，做一个类似的切口打开腹部（图1）。
6. 使用细镊子将膀胱轻轻地从腹部操作，并朝向包皮。这暴露了精囊和附着的前前叶（图1，和Oliveira等人，2016）。用细镊子，棉签轻轻地将一个精液囊泡和前列腺从肛门排出腹部，或轻轻地压在腹部（图1）。特别注意防止精液囊泡的损伤，因为精液渗入腹部会引起强烈的炎症反应。
7. 在将精囊露出和外观后，插入一个预先装有Myc-CaP细胞的25μlHamilton注射器：Matrigel混合物，并将30G½"针纵向配合到前列腺前（平行于精囊的长度）。慢性注射10μl混合物（等于1×10 6个Myc-CaP细胞）到前列腺中（图1）。当从前列腺去除针头时，注意避免注射的内容物溢出，因为溢出可能导致腹部多个肿瘤的播种。为了避免溢出，注射后保持针头1-2秒（使Matrigel时间在叶片内固化），并在取出针后用棉签轻轻按压注射部位。
  注意：在前叶中注入10μl以上会增加溢出的可能性。小鼠前列腺的其他裂片可以用于注射，然而，前叶提供了位置的便利性，并且在生长时尿道收缩的可能性降低。在实验过程中，移植网站的选择应保持一致。
8. 轻轻将精囊和膀胱返回腹部，然后用3-0连续可吸收的缝合线封闭腹壁。用9毫米钢伤口夹紧紧皮肤（图1）。
  注意：对于盲目的研究，按照制度指导标记具有脚趾纹身或耳朵的动物。给每只动物一个唯一的编号进行识别。
  
  图1.将Myc-CaP细胞移植到小鼠前列腺中A.在诱导全身麻醉后（步骤B2），用Betadine剃去手术部位，然后用酒精擦拭（步骤B4 ）。在注射腺上方形成1cm切口（步骤B5），暴露前列腺前（步骤B6）。将Myc-CaP细胞注射到前列腺前（步骤B7），然后用缝线和手术夹闭合切口（步骤B8）; B.假性腺体的解剖近似（P.G.，虚线）和切口部位（实线黑线）。阴囊（S）和包皮（P）标记为参考; C.切口部位的小鼠器官解剖。膀胱（B，显示为尿液）和精囊（S.V.，仅左侧暴露）分别容易地在切口部位识别其中线位置和白色喇叭形结构。前列腺前叶（A.P.）叶平行于沿其较小曲率附着的精囊运动。 D.增加Myc-CaP细胞注射入前列腺的观点
术后护理

手术部位闭合后，将动物放在消毒的加热垫上的干净的笼子中，以恢复恢复期间的体温

小鼠应在手术后2小时内积极进行警惕。间歇地监视鼠标，直到警惕。

每天监测小鼠遇难或感染的迹象，如新郎失败，体重减轻，不情愿移动，呼吸困难。

如果动物出现疼痛或痛苦迹象，术后每72小时皮下注射5毫克/千克卡洛芬。
尸检，加工染色
1. Myc-CaP细胞在转移灶中的存在可以通过用于雄激素受体（AR）和Myc阳性的福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织的免疫组织化学（IHC）染色来证实（图2）。 IHC染色方案从先前发表的研究（Simons等人，2015）中改编。
  
  图2.Myc-CaP原位同种异体移植物和H& E和IHC染色。 A.Myc-CaP小鼠前列腺前列腺同种异体移植物（箭头）。精囊（S.V.）和前列腺（A.P.）。 Myc和CaP原位异体移植肿瘤的Myc和雄激素受体（AR）的H& E和IHC染色; B.Myc-CaP原位同种异体移植肿瘤（T）和相邻精囊分泌物（S，亮粉色染色）的H& E和IHC染色; C.H& E和IHC染色的来自Myc-CaP原位同种异体移植物的肺转移。用ImmPRESS聚合物检测试剂盒和ImmPACT DAB（Vector Laboratories）显现阳性Myc和AR染色，显示为棕色。 IHC载玻片用苏木精复染。 10倍放大倍数（20x插图）和黑色条纹的图像为100μm。

数据分析

我们建议您考虑动物研究设计，分析和报告中的"体内动物研究指南（Kilkenny等，2010）。如"ARRIVE指南"中所概述的，综合记录研究设计，实验程序，实验动物，动物住房和畜牧业，样本量，动物分配到实验组，实验结果和统计方法（Kilkenny等人， em>。，2010）。为了确定样本大小（每个实验组和对照组的动物数量），首先计算连续和分类测量所需的效应大小。例如，如果在试点研究中，我们确定对照组的原发性肿瘤平均重（0.122 g±0.072 g），实验组原发肿瘤重（0.038 g±0.0133 g），则效应大小 = 1.622467。使用α误差概率为0.05，功率= 0.8，对照/实验的分配比为1的双侧测试，两组的样本量应为8只动物，以显示组间差异有统计学意义（Festing和Altman，2002）。要占20％的错误率，我们每组使用10只动物。
注意：首先应进行初步研究，以确定给定实验的适当样本量。我们强烈建议在任何动物研究的项目设计阶段咨询生物统计学家。
数据分析的适当统计方法将取决于评估的实验设计和实验结果。为了提高实验的鲁棒性，我们推荐两个独立的实验重复和盲目的数据分析。如果任何动物被排除在最终分析之外，提供排除的良好理由，例如细胞渗漏到体腔中，如体腔壁上的多发性转移病变所证明的。

食谱

Myc-CaP生长培养基
500毫升DMEM
50ml胎牛血清
5 ml青霉素 - 链霉素
25μg/ml牛垂体提取物 5μg/ml牛胰岛素 6ng/ml重组人表皮生长因子
注意：Myc-CaP细胞也可以在含有牛血清的DMEM中培养至终浓度为10％。

致谢

该协议由先前发表的研究（Hurley等人，2015年）改编而成。这项工作得到前列腺癌基金会哈根挑战奖的支持;帕特里克·沃尔什前列腺癌基金，以及欣曼泌尿基金教育奖学金。

参考文献

Bertrand，HG，Thomas，AA，Ellen，YC，Dorward，RS和Flecknell，PA（2016）。用于治疗小鼠睾丸内脓肿的手术方法。 BMC Vet Res 12：16.
Ellwood-Yen，K.，Graeber，TG，Wongvipat，J.，Iruela-Arispe，ML，Zhang，J.，Matusik，R.，Thomas，GV and Sawyers，CL（2003）。< a class = ke-insertfile"href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14522256"target ="_ blank"> Myc驱动的鼠前列腺癌与人前列腺肿瘤共享分子特征。癌细胞 4（3）：223-238。
Festing，MF和Altman，DG（2002）。指南对于使用实验室动物的实验的设计和统计分析。 ILAR J 43（4）：244-258。
Fiette L.和Slaoui，M.（2011）。啮齿动物的剖检和抽样程序。方法Mol Biol 691：39-67。
Fleming，JM，Miller，TC，Meyer，MJ，Ginsburg，E.and Vonderhaar，BK（2010）。< a class ="ke-insertfile"href ="https：//www.ncbi.nlm.nih。 gov/pubmed/20578247"target ="_ blank">人乳腺异种移植模型的局部调节。 J Cell Physiol 224（3）：795-806。
Greenberg，NM，DeMayo，F.，Finegold，MJ，Medina，D.，Tilley，WD，Aspinall，JO，Cunha，GR，Donjacour，AA，Matusik，RJ和Rosen，JM（1995） ="ke-insertfile"href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7724580"target ="_ blank">转基因小鼠中的前列腺癌。Proc Natl Acad Sci USA 92（8）：3439-3443。
Hoffman，RM（1999）。原位转移小鼠模型抗癌药物发现和评估：到诊所的桥梁。投资新药 17（4）：343-359。
Hubbard，GK，Mutton，LN，Khalili，M.，McMullin，RP，Hicks，JL，Bianchi-Frias，D.，Horn，LA，Kulac，I.，Moubarek，MS，Nelson，PS，Yegnasubramanian， De Marzo，AM和Bieberich，CJ（2016）。组合的MYC活化和Pten损失足以产生基因组不稳定性和致死转移性前列腺癌。 76（2）：283-292。
Hurley，PJ，Hughes，RM，Simons，BW，Huang，J.，Miller，RM，Shinder，B.，Haffner，MC，Esopi，D.，Kimura，Y.，Jabbari，J.，Ross，AE，Erho ，N.，Vergara，IA，Faraj，SF，Davicioni，E.，Netto，GJ，Yegnasubramanian，S.，An，SS和Schaeffer，EM（2015）。< a class ="ke-insertfile"href = "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26294211"target ="_ blank">肿瘤微环境中的雄激素调节SPARCL1抑制转移进展。癌症研究 75（20）：4322-4334。
Ittmann，M.，Huang，J.，Radaelli，E.，Martin，P.，Signoretti，S.，Sullivan，R.，Simons，BW，Ward，JM，Robinson，BD，Chu，GC，Loda，，Thomas，G.，Borowsky，A.and Cardiff，RD（2013）。人类前列腺癌的动物模型：纽约人类癌症联盟前列腺病理学委员会小鼠模型会议报告。癌症研究73（9）：2718-2736。
Kilkenny，C.，Browne，WJ，Cuthill，IC，Emerson，M.and Altman，DG（2010）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm.nih .gov/pubmed/20613859"target ="_ blank">改进生物科学研究报告：报告动物研究的ARRIVE指南。 PLoS Biol 8（6）：e1000412。
Killion，JJ，Radinsky，R.and Fidler，IJ（1998）。原位模型对于预测小鼠可移植肿瘤的治疗是必要的。癌症转移修正版17（3）：279-284。
Kuo，TH，Kubota，T.，Watanabe，M.，Furukawa，T.，Kase，S.，Tanino，H.，Saikawa，Y.，Ishibiki，K.，Kitajima，M。和Hoffman，RM（1993）。人类小细胞肺癌的位点特异性化学敏感性与SCID小鼠皮下生长相比较：原位模型获得相关药物评估数据的重要性。 抗癌研究<13>（3）：627-630。
Oliveira，DS，Dzinic，S.，Bonfil，AI，Saliganan，AD，Sheng，S.and Bonfil，RD（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi .nlm.nih.gov/pubmed/26773172"target ="_ blank">小鼠前列腺：一个基本的解剖学和组织学指导。博斯曼基础医学科学16（1）：8 -13。
Park，SI，Kim，SJ，McCauley，LK和Gallick，GE（2010）。< a class ="ke-insertfile"href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21483646 "target ="_ blank">人类前列腺癌的临床前小鼠模型及其在药物发现中的应用。 Curr Protoc Pharmacol 第14章：第14单元15.
Simons，BW，Durham，NM，Bruno，TC，Grosso，JF，Schaeffer，AJ，Ross，AE，Hurley，PJ，Berman，DM，Drake，CG，Thumbikat，P.and Schaeffer，EM（2015）人前列腺细菌分离物改变前列腺微环境并加速前列腺癌进展。 J Pathol 235（3）：478-489。
Slaoui，M.和Fiette，L.（2011）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20972747"target ="_ blank" >组织病理学程序：从组织抽样到组织病理学评估。方法Mol Biol 691：69-82。
Wang，S.，Gao，J.，Lei，Q.，Rozengurt，N.，Pritchard，C.，Jiao，J.，Thomas，GV，Li，G.，Roy-Burman，P.，Nelson， Liu，X.和Wu，H。（2003）。前列腺特异性删除鼠Pten肿瘤抑制基因导致转移性前列腺癌。癌细胞4（3）：209-221。
Watson，PA，Ellwood-Yen，K.，King，JC，Wongvipat，J.，Lebeau，MM and Sawyers，CL（2005）。< a class ="ke-insertfile"href ="https：//www .ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16357166"target ="_ blank">通过表征新型鼠前列腺癌细胞系揭示上下文依赖性激素难治性进展。癌症研究> 65（24）：11565-11571。
Wilmanns，C.，Fan，D.，O'Brian，CA，Bucana，CD and Fidler，IJ（1992）。原位和异位器官环境差异影响鼠结肠癌细胞对多柔比星和5-氟尿嘧啶的敏感性。 52（1）：98-104。