材料和试剂

塑料盒（60 x 45 x 15厘米）（临惠，目录号：LH-600）
灭菌湿沙子
刀片（宝神企业，KW-trio ^®，目录号：03541）
石蜡膜（Bemis，目录号：PM996）
一次性杯（嘉兴，目录号：热纸杯-HC02W）
塑料袋（义乌，目录号：10 * 15）
山东省农业科学院棉花研究中心济南市开发的棉花种子（SCRC41，商业Bt [苏云金芽孢杆菌]转基因棉[陆地棉]
硫酸H 2 SO 4（国药化学试剂，目录号：7664-93-9）
硝酸钙，Ca（NO 3 3）2（国药化学试剂，目录号：10124-37-5）
硝酸钾，KNO 3（国药化学试剂，目录号：7757-79-1）
硫酸镁，MgSO 4（国药化学试剂，目录号：7487-88-9）
磷酸二氢铵，NH 4 H 2 PO 4（国药化学试剂，目录号：7722-76-1）
EDTA·FeNa（国药化学试剂，目录号：15708-41-5）
正硼酸，H 3 BO 3（国药化学试剂，目录号：10043-35-3）
硫酸锌，ZnSO 4（国药化学试剂，目录号：7446-20-0）
硫酸铜，CuSO 4（国药化学试剂，目录号：7758-99-8）
硫酸锰，MnSO 4（国药化学试剂，目录号：15244-36-7）
（NH 4）6族Mo 7 O 24（国药化学试剂，目录号：12027-67-7 ）
氢氧化钾，KOH（国药化学试剂，目录号：1310-58-3）
营养液（参见食谱）

设备

生长室（Percival Scientific，型号：AR-41L2）
曝气仪（JeanPole，目录号：B00WDWUS8W）

程序

种子发芽
1. 用浓硫酸处理棉花种子2-3分钟，然后用流动的自来水冲洗种子6次
2. 之后，将湿种子在热空气流（50℃）中干燥8小时。
3. 在含有灭菌湿沙的塑料盒（60 x 45 x 15厘米）内，将约3厘米深的酸变甜的种子播种。
4. 将盒子放在具有16h/8h，光强度为400μmol/m 2 /秒以上的亮/暗方案的生长室中，PAR的温度为28℃ -32℃，相对湿度60-70％。
幼苗生长
1. 在种植后10天，将幼苗稀释至100个植物，完全出苗。
2. 当大多数幼苗在种植后15天达到2叶真叶期（图1-1）时，小心地将均匀的幼苗（同一天发芽的幼苗，具有相同的植物高度，叶数和叶面积）从沙子用水冲洗幼苗以除去所有的沙子。
  注意：嫁接前不要在苗下灌溉大约3天，以便容易地除去幼苗并引起根生长。
嫁接
1. 通过与幼苗嫁接建立分裂系统（图1）。简单地说，在两个子叶下方2厘米的下胚轴上用刀片做一个"/"形切口，约1/3的下胚轴组织完好无损。 '/'形切口与下胚轴之间的角度约为60°。
2. 将砧木顶部切成与下一根幼苗下胚轴相同位置的深层"ʌ"。然后将"ʌ"部分插入植物的"/"切口，并用Parafilm紧密包裹幼苗。
  
  图1.移植物分裂根系统的顺序步骤示意图。 1. Scion;库存; 3和4.嫁接棉。
嫁接幼苗管理
1. 将移植的幼苗转移到含有充气营养液的一次性杯中，用水喷洒幼苗，并立即用塑料袋覆盖，以防止枯萎（图2）。通过曝气仪将空气引入营养液中以维持营养液中的氧浓度。
2. 我们每天用去离子水顶部营养液，而不是改变整个营养液，因为嫁接苗每天摄取一点水和营养。
3. 移植后一周新移植的秧苗出现一周后，取出塑料袋和Parafilm（图3）。
4. 将具有两个均匀分裂根系的嫁接幼苗转移到28-32℃和60-70％相对湿度下的生长室中20天。
5. 在生长期间每天更新营养液。
  
  图2.移植到一次性杯中的嫁接植物
  
  图3.嫁接后一周从嫁接幼苗出现的新叶子

数据分析

嫁接苗的存活率超过95％，其中大部分存在两个均匀的根系（kong et al。，2012）（图4）。成功接种的棉花苗具有两个均匀的根系。在这个阶段，用作接穗的幼苗与库存无法区分。

图4.接枝棉。嫁接部位的木质部（1）和韧皮部（2）。

笔记

选择均匀发芽的种子和幼苗，以确保磨碎的幼苗具有两个均匀的分裂根系。

食谱

营养液
1.25mM Ca（NO 3 3）2
1.25mM KNO 3
0.5mM MgSO 4
0.25mM NH 4 H 2 PO 4
0.05 mM EDTA·FeNa
10μMH 3 3
0.5μMZnSO 4
0.1μMCuSO 4
0.5μMMnSO 4
0.0025微米（NH 4）6以下的第7个O 2 O 2/2><> 用KOH调节pH至6

注意：本实验中使用的营养液不需要消毒。可以提前制作，并在4°C下储存一个月。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金（授权号31371573和31501249），泰山学者专项资金（Tspd20150213和tshw20110218），山东省自然科学基金（ZR2015QZ03），种子项目山东省（2014-棉花），山东省农业科学院农业科技创新项目（CXGC2016C04）和青年科学研究基金（2011QNZ01）。

参考文献

Kong，X.，Luo，Z.，Dong，H.，Eneji，AE and Li，W（2012）。不均匀根区盐度对水分的影响，Na ⁺再循环，Na ⁺和H ⁺在棉花中的通量。 J Exp Bot 63（5）：2105-2116。
Kong，X.，Luo，Z.，Dong，H.，Eneji，AE and Li，W.（2016）。 H _{2 ₂，ABA信号负责增加的Na ⁺在不均匀的根区盐度下，非生理盐水中的陆地陆地棉根部的外排和吸水量为67（8）：2247-2261。}
Bazihizina，N.，Colmer，TD和Barrett-Lennard，EG（2009）。对盐藻根区的不均匀盐度的响应Atriplex nummularia ：生长，光合作用，水分关系和组织离子浓度。 Ann Bot 104：737-745。
Dong，HZ，Kong，XQ，Luo，Z.，Li，WJ and Xin，CS（2010）。根区的不均匀盐分布增加了棉花的增长和产量。 Eur J Agron 33：285-292。