材料和试剂

组织培养6孔板（Corning，Costar ^{®，目录号：3516）}
Nunc ^TM 8.8cm ^{2培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：153066）}}
1毫升滑头Sub-Q注射器与一次性26 G x 5/8英寸针（BD，目录号：309597）
高压灭菌吸管技巧：
1. 200-1,000μl蓝，吉尔森提示（Greiner Bio One，目录号：740290）
2. 200μl通用尖端（Neptune Scientific，目录号：2100.N）
3. 0.5-10μl吸头（Corning，Axygen ^{®，目录号：T-300）}
FACS管（Corning，Falcon ^{®，型号：352054）}
灭菌40μm孔径尼龙网（Sinun Tech，目录号：Plymer Screends）（参见食谱）
小鼠
纤连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：F0895）
人CXCL12（人类SDF-1α）（繁殖，目录号：RKP48061）或（PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A9647）
Lymphoprep ^TM Ficoll（STEMCELL Technologies，目录号：07861）
抗体：
1. EPCR PE（Affymetrix，eBioscience，目录号：12-2012-82）或EPCR PerCP-eFluor 710（Affymetrix，eBioscience，目录号：46-2012-80）或EPCR生物素（Affymetrix，eBioscience，目录号：13-2012 -82）与链霉亲和素-PE（BioLegend，目录号：405203）结合使用
2. Sca-1 PE（BioLegend，目录号：108108）或Sca-1 PE/Cy7（BioLegend，目录号：108114
3. c-Kit APC（BioLegend，目录号：105812）
4. 谱系抗体
  注意：这是一组针对以下列出的抗原i-vi的抗体，其是细胞谱系标记。在小鼠中，这些标记物不会发生在干细胞和祖细胞上
  1. CD8a FITC（BioLegend，目录号：100706）
  2. CD4 FITC（BioLegend，目录号：100406）
  3. GR1 FITC（BioLegend，目录号：108406）
  4. B220 FITC（BioLegend，目录号：103206）
  5. TER-119 FITC（BioLegend，目录号：116206）
  6. CD11b FITC（BioLegend，目录号：101206）
  7. 或血清鸡尾酒生物素（Miltenyi Biotec，目录号：130-092-613）与链霉抗生物素蛋白FITC（BioLegend;目录号：405202）结合
    注意：用于实验的荧光团的组合需要根据实验需求进行调整。
1x Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水，不含钙和镁（PBS（PBS），见Recipes）（Biological Industries，目录号：02-023-5A）
Roswell公园纪念研究所（RPMI）1640培养基（[+] 300mg/L L-谷氨酰胺，[+] 25mM HEPES）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：52400025）}
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{，目录号：12657-029）}
青霉素 - 链霉素（Pen-Strep）溶液（Biological Industries，目录号：03-031-1B）
L-谷氨酰胺溶液（Biological Industries，目录号：03-020-1B）
龙胆紫（Sigma-Aldrich，目录号：G2039）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：ARK2183）
0.1M叠氮化钠溶液（Sigma-Aldrich，目录号：08591）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：40289）
注意：本产品已停产。
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：24103）
注意：本产品已停产。
细胞解离溶液（Sigma-Aldrich，目录号：C5914）
ddH ₂ O
涂层溶液（见配方）
用2％（m/v）BSA封闭溶液（参见食谱）
完成RPMI培养基（见食谱）
土耳其语的解决方案（见食谱）
FACS缓冲液（参见食谱）

设备

Heacell孵化器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{，型号：150i CO 2孵育器）}
高压灭菌器
剪刀
镊子
冰箱（4°C）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
离心机摇摆转子A-462 4×250毫升矩形桶（Eppendorf，目录号：5810709008）
适配器（Eppendorf，目录号：5810752000）
Finnipipette型号4500单通道移液器：

0.5-10μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，目录号：FA-10R）
5-40μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，目录号：FA-40R）
20-200μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，目录号：FA-200R）
100-1,000μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，目录号：FA-1000R）

倒置光学显微镜（Olympus，型号：CHK2-F-GS）
注意：本产品已经被制造商停产。
计数室/血细胞计数器（Reichert Bright-Line）（Sigma-AIdrich，Bright-Line ^{TM，型号：Z359629）}
流式细胞仪（型号可选）：
1. MACSQuant VYB仪器（Miltenyi Biotec，型号：130096116）
2. FACSCalibur仪器（BD）
3. FACS LSRII仪器（全部四个固定校准激光器）（BD）

软件

CellQuest软件
FACSDiva软件
FlowJo（Tree Star或V10）或MacsQuant

程序

涂层和制备
1. 在4℃下，将具有25μg/ml纤连蛋白和2.5μg/ml CXCL12的涂层组织培养6孔板过夜。对于涂层，建议在PBS ^{-/- （涂层介质）中制备纤连蛋白和CXCL12的混合物，并计算所需的量，以使每孔用500μl涂层培养基覆盖。将纤连蛋白原（1mg/ml）和CXCL12（50μg/ml）储存于-20℃。}
2. 孵育过夜后，轻轻丢弃涂层培养基，并用1 ml PBS /平板洗涤平板几秒钟。重复洗涤3次。
3. 在室温下，用PBS 中的2％BSA进行30分钟的封闭。封闭溶液应覆盖板的每个孔，因此建议每个孔使用至少500μl的封闭溶液。
4. 轻轻倒掉封闭溶液，并用1 ml PBS /洗涤板数秒钟，同时缓慢倾斜板。重复洗涤3次。
5. 板准备接种BM单核细胞。
获得骨髓单核细胞
1. 通过CO 2安乐死或颈椎脱位牺牲所需的小鼠。
2. 使用镊子和锋利的剪刀提取股骨，胫骨和骨盆。将骨头放在补充有PBS ^-/-的小盘子上。
3. 使用1ml注射器和16G针头（图1），用1-2ml PBS（每只小鼠）从骨腔中冲洗总骨髓细胞。通过使用相同的注射器重悬细胞溶液来获得单细胞悬液。
  
  图1.从鼠胫骨冲洗骨髓的过程。提取的骨骼的红色表示存在BM（A）。将针头钻入骨头并用PBS将骨骼（B）从骨头（B）中冲洗，直到骨头看起来足够白（C）。
4. 仔细移取（非常慢）的每个管的底部，稀释比为1：2与骨髓细胞（如，如果您在PBS中总共有2ml骨髓细胞，将1毫升ficoll移液到管底部）（图2A和2B）
  
  图2. MNC从BM中分离的过程将Ficoll加入到悬浮的BM（A）下面的管底部，形成较低的澄清Ficoll相和上细胞悬浮相（B）。离心后，两相由MNC（C）组成的薄白相分离，BM分离更为显着（D）。
5. 将细胞以652 x g离心25分钟，在室温下无刹车（重要）（如果离心机冷却，则单核细胞不会分离）。
6. 小心地从离心机中取出管子。在中期，应形成细小的白色环状形状，含有骨髓单核细胞（图2C和2D）
7. 小心地，用移液管丢弃环上方的液体，同时避免接触单核级分。用200μl移液器吸头将细胞环收集到新的FACS管中
8. 用2ml PBS洗涤收集的单核细胞，并以452.8×g离心细胞5分钟。
9. 丢弃上清液并将细胞沉淀重悬于1ml完整的RPMI中（参见食谱）。
10. 用Turk的溶液稀释细胞1:10计数细胞。使用血细胞计数器在倒置光学显微镜下计数细胞。一只老鼠通常会得到20-40万个单核细胞。
粘附试验（图3）
1. 每1ml完全RPMI培养基的密度为5×10 6个细胞的种子骨髓单核细胞。
2. 允许细胞在37℃下在培养箱中粘附到包被的板上2小时。
3. 通过用完整的RPMI培养基轻轻冲洗每个孔，将非贴壁细胞收集到新的FACS管中。确保不要触摸底部，只能通过将移液管针头放在每个孔的墙壁上来添加RPMI。
4. 通过前后倾斜板轻轻洗板3次，PBS ^{-/- 确保不要触摸底部，只能通过将移液管针头放在每口井的墙壁上来添加PBS ^-/-。}
5. 为了收集贴壁细胞，在培养箱中37℃孵育平板与细胞解离缓冲液10分钟。
6. 在倒置显微镜下监测细胞。如果细胞仍然连接到底部，则通过使用移液管重悬细胞，并在细胞解离缓冲液存在下孵育平板另外5-10分钟。
7. 一旦细胞从孔中分离出来，用移液管大力冲洗每个孔，并将粘附部分收集到新的FACS管中。随后，向每个孔中加入1ml冰冷PBS，将其彻底冲洗，并将流体收集到贴壁细胞部分中至不同的FACS管中。
8. 在倒置显微镜下监测细胞。如果额外的细胞残留在平板上，用冰冷的PBS重新冲洗每个孔，并继续将流体收集到贴壁细胞部分中。
9. 以452.8×g离心粘附和非贴壁细胞级分5分钟。
10. 仔细舍弃上清液。
11. 向每个颗粒加入100μlPBS。细胞现在可以被染色和分析。
FACS染色和分析（图4）
1. 在每个管的底部添加1μl每个谱系抗体（CD8a FITC，CD4 FITC，GR1 FITC，B220 FITC，TER-119 FITC，CD11b FITC）和2μlSca1 PeCy7，cKit APC和EPCR PE抗体至剩余溶液。
  注意：不要忘记包括阴性对照，以便能够在流式细胞仪中区分自发荧光和阳性信号。
2. 简单地涡旋管重新悬浮颗粒。
3. 将样品放在4°C 30分钟注意：如果使用生物素偶联的抗体，则在4℃下孵育后将细胞重悬于1ml PBS中，并重复步骤C9至该步骤。在步骤D1，向每个管的剩余溶液中加入1μlFITC偶联的链霉亲和素。
4. 将每个样品重悬于1 ml FACS缓冲液中，并通过40μm筛网过滤到新管中，以避免流式细胞术中出现凝块。
5. 以452.8×g离心样品5分钟。
6. 仔细弃去上清液，向每个样品中加入300μlFACS缓冲液，并通过涡旋重悬细胞
7. 使用流式细胞仪读取样品。用具有CellQuest软件的FACSCalibur仪器，MacsQuant仪器或具有FACSDiva软件的FACS LSRII仪器分析细胞群体。请考虑一些荧光团的组合可能会导致流式细胞仪内的信号重叠。因此，设定好的补偿是强制性的
8. 数据使用FlowJo（Tree Star或V10）或MacsQuant根据图1所示的门控策略进行分析（参见数据分析部分）：
  1. 使用正向（FSC）和侧向散射（SSC）的活细胞门。
  2. 使用SSC的谱系阴性细胞的门和与谱系抗体偶联的荧光团的通道（图5）。
  3. SK细胞门选择c-Kit阳性和Sca-1阳性细胞群（图5）
  4. 创建一个直方图覆盖，显示阴性对照中LSK群体的EPCR信号，粘附和非粘附级数。
    
    图3.显示粘附测定程序步骤的图（步骤C）
    
    图4.显示FACS染色程序步骤（方法D）的图示
    
    图5. EPCR阳性骨髓LSK细胞的门控策略（改编自Gur-Cohen等人，2015年的Supp图5a）

数据分析

有关门控策略和统计分析的进一步分析信息，您可以参考Gur-Cohen等人的文章。（2015）在以下链接： http://www.nature.com/nm/journal/v21/n11/full/nm.3960.html 。

食谱

1x PBS ^-/-
加入50毫升10倍的PBS至450毫升的dH 2 O -/-
涂层溶液
1×PBS，25μg/ml纤连蛋白和2.5μg/ml CXCL12
2％（m/v）BSA阻塞溶液
每100ml 1x PBS加入2μgBSA
完成RPMI培训
88％RPMI 1640培养基
10％FBS
1％Pen-Strep溶液
1％L-谷氨酰胺溶液
土耳其的解决方案
50毫升龙胆紫色
5毫升乙酸
495毫升的ddH 2 O -/- 在乙酸和ddH 2 O中稀释龙胆紫 -
FACS缓冲区
注意：将此缓冲液混合在塑料瓶中。
450毫升ddH 2 O -/- 18μl叠氮化钠
50ml 10x PBS
5 ml FBS
灭菌的24μm孔径尼龙网

将尼龙网切成约3 x 3件
在化学引擎罩下，在丙酮中室温孵育20分钟
在室温下用无水乙醇培养网眼20分钟
让网格过夜干净
通过在121℃高压灭菌60分钟来灭菌网眼

致谢

这项研究得到了以色列科学基金会（851/13），欧内斯特和邦妮·贝特勒基因组医学优秀研究计划和FP7-HEALTH-2010（CELL-PID 261387）（T.L.）和德国DKFZ的支持。

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