材料和试剂

针注射器1 ml 25 G x 5/8 in。（0.5 x 16 mm）（BD，目录号：300014）
菜肴35 x 10（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：153066）
70μm尼龙过滤器（Sinun Tech，目录号：Polymer Screens）
FACS管（Corning，Falcon ^TM，目录号：352054）
感兴趣的细胞（这里是从8周龄小鼠获得的鼠骨髓细胞）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS ^+/+）（Biological Industries，目录号：02-020-1A）
EDTA（5mM终浓度在水中，pH7.4）（Avantor，Performance Materials，J.T.Baker，目录号：8993-01）
湿冰
通过流式细胞术检测LT-HSC的抗体：

Sca-1 PEcy7（克隆D7）（Biolegend，目录号：108114）
c-kit APC（克隆2B8）（Biolegend，目录号：105812）
CD150 Brilliant Violet（克隆TC15-12F12.2）（Biolegend，目录号：115922）
CD48 Pasific Blue（克隆HM48-1）（Biolegend，目录号：103418）
EPCR PE（克隆eBio1560）（Affymetrix，eBioscience，目录号：12-2012-82）
谱系：CD4（克隆GK1.5），CD8a（克隆53-6.7），GR1（克隆RB6-8C5），B220（克隆RA3-682），Ter119（克隆TER-119），CD11b（克隆M1/70） />

氯化钙二水合物（EMD Millipore，目录号：102382）
六水合氯化镁（EMD Millipore，目录号：105833）
HEPES缓冲溶液（Biological Industries，目录号：03-025-1B）
Hank的平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14175095）}
牛血清白蛋白溶液（10％，BSA）（Biological Industries，目录号：03-010-1B）
2.4 - （（（N，2-甲基苯基）脲基） - 苯基乙酰基-L-亮氨酰-L-天冬氨酰基-L-缬氨酰-L-脯氨酰基-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-赖氨酸（LDV-FITC）（R& D系统，目录号：4577）
去离子水（DDW）
龙胆紫（Sigma-Aldrich，目录号：548-62-9）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：64-19-7）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：30525-89-4）
LDV培养基（参见食谱）
LDV-FITC库存和工作解决方案（见配方）
土耳其语的解决方案（见食谱）
4％PFA（见食谱）

注意：荧光灯应根据流式细胞仪选择。

设备

镊子（Kent Scientific，目录号：INS700100-2）
剪刀（Kent Scientific，目录号：INS750046）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
离心机摇摆转子A-462 4×250毫升矩形桶（Eppendorf，目录号：5810709008）
适配器（Eppendorf，目录号：5810752000）
倒置光学显微镜（Olympus，型号：CHK2-F-GS）
注意：本产品已经被制造商停产。
血细胞计数器（Sigma-Aldrich，Bright-Line ^{TM，目录号：Z359629）}
培养箱37℃，5％CO 2（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，supers TM，型号：150i）
冷藏室或冰箱（4°C）
流式细胞仪（即，ems，即，Macs Quant仪器[Miltenyi，BergischGladbach，德国]或BD LSR II流式细胞仪）
2升玻璃瓶或瓶（Kimble Chase Life Science and Research Products，目录号：26500-2000）
塑料称重船（Sigma-Aldrich，目录号：Z186856）

注意：可以调整颜色组合以匹配可用的激光组合。

软件

FlowJo V10软件（Tree Star，可选）

程序

获取小鼠骨髓细胞
注意：所有动物实验必须经当地动物护理和道德管理当局批准。
1. 通过CO 2安全化或子宫颈脱位来牺牲所需的小鼠株。
2. 使用镊子和锋利的剪刀提取股骨，胫骨和髂骨骨骼。将骨头放在冰上加上PBS ^+/+的小盘子上。
3. 使用1ml注射器和25G针将1-5ml冰冷PBS（每只小鼠）从骨腔中冲洗总骨髓细胞。通过使用相同的注射器简单地重悬细胞溶液来获得单细胞悬液。
  
  图1.从小鼠骨骼中冲洗骨髓的过程。 A.冲洗前的股骨，胫骨和髂骨骨骼; B.潮红后的股骨，胫骨和髂骨骨头; C. 1 ml注射器，其25 G针插入胫骨骨腔
4. 通过使细胞溶液通过70μm尼龙过滤器过滤细胞，以获得均匀的单细胞悬浮液
5. 离心细胞（289.5×g，5分钟），并重悬于1ml LDV培养基中。
6. 用Turk的溶液稀释细胞1:10计数细胞。使用血细胞计数器在倒置光学显微镜下计数细胞。一只老鼠通常会从股骨和胫骨和髂骨骨骼获得60-90万个细胞。
使用流式细胞术（LDV测定）测定VLA-4亲和力可以从获自治疗动物的新鲜骨髓细胞上检查VLA-4亲和力。或者，可以从未处理的动物获得细胞，并在LDV培养基的存在下用所需的试剂在体外处理细胞，随后用上述详细方案。
注意：建议在分离骨髓细胞后继续染色。
1. 将500万个骨髓细胞在FACS管中放入总体积为100μl的LDV培养基（参见食谱）。
2. 加入LDV-FITC以达到10nM的最终浓度（参见食谱），并通过移液轻轻混合，不要旋涡。
3. 为了确定LDV-FITC非特异性结合，在每个LDV-FITC样品中加入EDTA至终浓度为5 mM。
4. 在37℃下孵育所有样品30分钟。
5. 孵育后，将管子立即放在湿冰上，加入冰冷的4％PFA 10分钟（即反应在100μl细胞中）固定细胞，从而加入4％PFA [ 1-2 ml]直接加入管中）。从那时起，细胞需要保持在寒冷的条件下在湿冰上。沿程序避免涡旋。
6. 用2ml冰冷PBS ^+/+洗涤细胞。
7. 离心细胞（289.5×g，5分钟），轻轻丢弃上清液。
8. 加入100μl冰冷的PBS ^+/+，并进行细胞表面标志物的染色谱系（每个抗原每个样品1-2μl），Sca-1（2μl/样品），c-试剂盒（2μl/样品），CD150（2μl/样品），CD48（1μl/样品）和EPCR（2μl/样品）。这些细胞表面标志物只是用于检测LT-HSC的提示抗原，但是这可以根据研究问题的需要进行调整。颜色组合应适合FITC，因为LDV肽与FITC荧光染料缀合。
9. 将所需的抗体添加到细胞样品中，通过移液（不要旋涡）轻轻混合，并在冰上孵育30分钟并防止光照。
10. 用1ml冰冷的PBS，将离心机（289.5×g，5分钟）洗涤细胞，轻轻丢弃上清液。
11. 将细胞重悬在300μlPBS/sup + + +/+，不要旋涡。
12. 通过流式细胞术立即读取样品，并通过分析门控谱系上的FITC荧光染料的强度来确定LDV与LT-HSC的结合。/c-Kit ^{+/sup>/Sca-1 ⁺/CD150 ⁺/CD48 ^-/EPCR ⁺}

数据分析

图2.通过LDV探针结合骨髓EPCR测量的VLA4亲和力 ⁺ SK（Sca1 ^{< strong> +} ckit ⁺ ）SLAM（CD150 ⁺ CD48 ^- 细胞用EDTA;在蓝色的EPCR +电池门控SLAM/SK;在SLAM/SK上的EPCR细胞粉红色。

有关门控策略和统计分析的进一步分析信息，您可以在以下链接中查阅文章Gur-Cohen等：。 http://www.nature.com/nm/journal/v21/n11/full/nm.3960.html

食谱

LDV介质
1mM CaCl 2
1mM MgCl 2
含有1％BSA的20mM HEPES 注意：建议制备1 M CaCl 2 2（直接在培养基中稀释1：1,000）以及100 mM MgCl 2（稀释）的储备溶液1：100直接在媒体中）。
LDV-FITC库存和工作解决方案
根据制造说明书（给出0.73mM的库存浓度），将1mg LDV-FITC粉末溶于1ml DDW（ddH 2 O）中。
注意：建议将溶液分成小等分试样，避免反复冻融循环（溶液可在-20°C储存长达1年）。
为了制备工作的LDV-FITC溶液，用DDW稀释储备溶液，达到10nM的终浓度（对于10nM工作溶液，用DDW稀释1：730，并将1μl加入到补充有LDV培养基的100μl细胞中） />
土耳其语解决方案
50毫升龙胆紫色
5 ml乙酸
495 ml DDW
将龙胆紫溶解于乙酸和DDW中
4％PFA
将40克粉状多聚甲醛重量放入塑料称重船中倒入2升玻璃瓶或瓶子
加入1L DDW，搅拌棒，温热至65°C，缓慢搅拌5分钟加入一滴10N KOH或10N NaOH碱，溶液应该变得清晰
让溶液在室温下冷却，并将pH调节至7.3
注意：较小的体积可以在-20°C保存长达一年。

致谢

这项研究得到了以色列科学基金会（851/13），欧内斯特和邦妮·贝特勒基因组医学优秀研究计划和FP7-HEALTH-2010（CELL-PID 261387）（T.L.）和德国DKFZ的支持。

参考文献

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