材料和试剂

微量离心管（1.5ml用于尿液收集，2.0ml用于组织匀浆）
1 ml注射器（BD，目录号：309628）
27 G针（BD，目录号：305136）
ELISA板（Nunc MaxiSorp平底96孔板）（Sigma-Aldrich，目录号：M9410）
未磨砂或磨砂玻璃片（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10149870）
聚-L-赖氨酸包被的玻片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：P4981）}
盖片60 x 24毫米
小鼠
只有雌性小鼠被用于UTI感染模型，因为雄性小鼠的尿道由于其解剖学而非常难以导管。使用下列8至16周龄的小鼠：
C57BL/6
模型中成功地使用了以下敲除小鼠来研究许多宿主防御基因的相关性，但是这些小鼠是可选的，不需要产生模型：
Tlr4 ^-/-
Myd88 -/-

Irf3 ^-/-
注意：所有敲除小鼠与C57BL/6小鼠回交至少8x回交。将所有小鼠繁殖并饲养在特定的无病原体条件下。小鼠仅在当地动物实验伦理委员会允许的情况下使用。
细菌
1. UPEC菌株CFT073，由ATCC（ATCC，目录号：700928）提供
2. 使用Datsenko/Wanner（Datsenko和Wanner，2000）描述的方法在实验室中生成的tcpC -deficient CFT073 tcpC :: kan 。
3. 补体突变菌株CFT073 > pTcpC，如所述（Cirl等人，2008）产生质粒。
注意：用于接种动物的细菌菌株保持在含有适当抗生素的LB琼脂平板上。将菌株在胰蛋白酶大豆琼脂上生长过夜。在磷酸盐缓冲盐水中收获细菌，随后根据标准物质调节细菌细胞密度（OD 597 = 1对应于1×10 9细菌/ml）通过在磷酸盐缓冲盐水中稀释，在597nm处的吸光度曲线的浓度为每10毫升10 10细菌。
冰
干冰
乙醇（70％）
异氟烷（Abbott Laboratories，Forene ，目录号：506949）
氯胺酮（Ketaminol ^®，目录号：511519）
赛拉嗪（Rompun ^®，目录号：022545）
0.9％NaCl
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8662）
庆大霉素
Tissue-Tek ^® O.C.T.化合物（SAKURA FINETEK，目录号：4583）
Tissue-Tek ^® Cryomold（SAKURA FINETEK，目录号：4565）
异戊烷（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1661）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
正常山羊血清（Agilent Technologies，目录号：X0907）
大鼠单克隆抗体NIMP-R14（1:200）（Abcam，目录号：ab2557）
在实验室中生产的PapG粘附素（1：200）中的合成肽的抗血清
与Alexa 488染料（A488; 495ext/519em nm）缀合的山羊抗大鼠免疫球蛋白（1：200）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，Sup。，目录号：A-11006）
与Alexa 568染料（A568; 578ext/603em nm）缀合的山羊抗兔免疫球蛋白（1：200）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11011）
抗NLRP3抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-66846）
抗IL-1β抗体（Abcam，目录号：ab9722）
抗ASC抗体（Abcam，目录号：ab155970）
DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
VECTASHIELD安装介质（Vector Laboratories，目录号：H-1000）
MIP-2量化试剂盒（R& D Systems，目录号：MM200）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）（BD，Difco ^{TM，目录号：236950）}
LB琼脂（BD，目录号：244520）
哥伦比亚5％血琼脂（BD，目录号：221263）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84100）
氯胺酮/赛拉嗪溶液（见配方）
培养细菌培养基（见食谱）
胰蛋白酶大豆琼脂平板，LB，哥伦比亚5％血琼脂
蔗糖溶液（参见食谱）
4％多聚甲醛（见食谱）

设备

Burker室
ELISA洗衣机
滴玻璃瓶气体麻醉
生物安全二级设施生物安全罩
弯曲镊子，剪刀
软聚乙烯导管（外径0.61 mm;粘土亚当斯）（BD，目录号：427401）
Stomacher 80均质机（Seward medical，目录号：0080/000/EU）
冷冻机切片用切片刀C-35（FEATHER安全剃刀，型号：C-35）制成
荧光显微镜（Olympus，型号：AX60，配有滤光片组[激发/发射] 495ext/519em nm和578ext/603em nm）
AxioCam ERc 5s相机（Zeiss，型号：AxioCam ERc 5s）
Labsystems Multiskan PLUS阅读器（Analytical Instruments，Golden Valley，USA）

程序

感染模型（直接滴入细菌进膀胱）
小鼠的感染方案最初由Hagberg等人描述。（1983），并被Cirl等人进一步修改。（2008），Yadav等人。（2010）和Waldhuber等人。（2016）。
1. 为了取样尿液，将鼠标放置在笼子的金属网上。提起故事和后腿后，鼠标将牢牢地握在笼子上，使前腿伸展腹部并露出下侧。小鼠膀胱现在通过用食指在腹部区域进行温和的手动压缩（图1）清空，并将尿液收集在无菌微量离心管中（保存在冰上）。收集的尿液可用于定量TSA平板上的集落形成单位（CFU），用于检查炎性细胞（例如嗜中性粒细胞）或通过ELISA进行细胞因子分析。也可以在麻醉后收集尿液
  
  图1.小鼠中的尿液收集。将鼠标放在网状金属网上，并抓住尾巴抬起后腿。大多数小鼠自然排尿，尿液可以收集在无菌微量离心管中。有时使用食指，可以应用腹部轻微的压力来鼓励小鼠排尿。
2. 使用异氟烷在滴玻璃罐中麻醉动物，或通过腹膜内注射氯胺酮 - 赛拉嗪混合物（Xylazin：6-8mg/kg体重，Ketamin：90-120mg/kg体重（正常体重8- 16周龄小鼠：19-23g）在0.9％NaCl中;稀释至终体积为100-200μl/小鼠以进行ip给药）
3. 如果在麻醉之前没有完成，膀胱现在通过轻轻的腹部压缩而排空。一滴尿直接在尿道口处用校准回路（摄取10μl流体）直接捕获并铺展在血琼脂平板上，以确保小鼠未感染。
4. 此后，立即将适用于1毫升结核菌素注射器（供应商BD）上的0.4×20毫米规格针的软质聚乙烯导管（0.61mm外径; Clay Adams）经尿道插入膀胱。
  注意：通过轻轻地抓住并拉出鼠标的阴蒂部分，尿道被拉直并允许进行快速和无创性的导管插入。在使用鼠标将导管插入背部之前，我们使用镊子拉动组织（图2）。
  
  图2.小鼠尿路感染模型 显示经尿道导管插入期间小鼠位置的图像。
5. 我们在大多数实验中使用高剂量模型，并灌注0.1ml含有2×10 8或1×10 9 cfu/ml的细菌悬浮液。在一些实验中，我们将细菌数量降至2×10 5 /小鼠（低剂量模型），以研究IL-1β缺乏对细菌负担的影响。
6. 注射后，立即取出导管，不进行进一步的操作。对照小鼠注射无菌PBS
7. 然后该模型可用于研究膀胱和/或肾脏感染（图3）
  
  图3.小鼠上升的尿路感染小鼠用E感染。大肠杆菌CFT073通过膀胱内接种并在7天后处死。 A.未感染的对照小鼠显示具有光滑圆形轮廓的健康肾脏，而来自感染小鼠的肾脏显示严重的脓肿（箭头）形成（B）。
监测感染
1. 通过连续的尿培养物监测小鼠尿道中细菌的形成和持续性，直至处死。
2. 通过小鼠腹部（5小时，24小时和最多7天）的温和压力将尿液收集到无菌管中，并通过使用Burker腔的光学显微镜来定量中性粒细胞。
3. 在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）板上定量培养尿液样品和连续稀释液（起始稀释1:100，然后在PBS中1:100,000,1:100,000）。 LB或哥伦比亚5％血琼脂平板是很好的选择。 TSA板不含抗生素，因为没有抗生素可以在实验菌株和任何可能的污染物之间进行选择。实验菌株和可能的污染细菌通过菌落形态分化。此外，假冒感染的对照也可能揭示可能的污染，但这些只是很少发生。
4. 经无菌条件处死后，将膀胱和肾脏置于无菌条件下，放入含有5ml PBS（pH 7.2）的塑料袋中，并在Stomacher 80均质机中匀浆（100转/分钟，5分钟;仪器用70样品之间的酒精％）。
5. 将样品置于冰上，并在TSA平板上连续稀释分析。细菌数量表示为每个整个组织的CFU数。
6. 通过用庆大霉素（200μg/ml）杀死细胞外细菌并随后洗涤和匀浆剩余的器官来确定细胞内细菌的数量（Notes中的更多信息）。
7. 随后，将血琼脂和TSA平板在37℃下孵育过夜，目视评价细菌菌落
感染后分析
1. 组织学
  1. 肾脏和膀胱在处死后立即固定在1ml新鲜制备的4％PFA中，并在4℃温育过夜。
  2. 随后，将固定的组织在15％蔗糖（4℃/24小时）中孵育，并在25％冰冷的蔗糖（4℃/24小时）中洗涤。然后将组织嵌入O.C.T.复合并在-40℃的异戊烷中冷冻并储存在-80℃下进一步使用。冷冻切片（厚度5μm）用切片刀C-35制成，并安装在聚-L-赖氨酸涂层的玻璃片上并染色。
  3. 来自不同组小鼠的肾切片经双重染色，通过免疫组化进行分析
2. 免疫组织化学
3. 细胞因子测量

数据分析

尿中的细菌负荷，尿细胞因子含量，尿中多形核白细胞数等参数，表示为至少3只单独小鼠的平均加/减标准差。通过Mann-Whitney秩和检验（Waldhuber等人，2016），Student's -test（Yadav等）比较了两组以上的统计学差异al。，2010）或Fisher精确检验（Cirl等人，2008）。多组分析通过单因素方差分析，事件Bonferroni的多重比较检验（Cirl等人，2008; Waldhuber等人，2016）分析。

笔记

注意：CFT073的细胞内检测

用CFT073经尿道感染小鼠。
感染后第3或7天，手术切除膀胱
通过在三角形中插入小剪刀将其切开，并进一步切割成顶点。
如果需要，用500μlPBS轻轻冲洗，除去附着的细菌和残留的尿液。
将剩余的切开的膀胱浸入庆大霉素溶液（200μg/ml，15分钟）中以杀死细胞外细菌。
然后将膀胱在PBS中冲洗两次，将膀胱转移到含有PBS /吐温（0.3％，v/v）和钢球（4mm不锈钢）的微量离心杯（2ml，Eppendorf）中。
将样品储存在冰上（在匀浆期间避免过热至关重要），直到用Retsch MM200组织匀浆器进行均化30秒。频率为30 /秒。将样品放回冰上并以连续稀释度进行分析。
将制备的材料铺在血琼脂平板上，并计数个体菌落。

食谱

氯胺酮/赛拉嗪溶液
Xylazin：6-8 mg/kg体重
氯胺酮：在0.9％NaCl中90-120mg/kg体重
稀释至100-200μl/小鼠的终体积。管理
培养细菌的培养基

胰蛋白酶大豆琼脂板

在1升蒸馏水中加入40粒粉末
加热至沸腾，同时搅拌溶解粉末
在121℃高压灭菌15分钟以消毒
允许冷却至约50℃。倒入培养皿中，使其固化（厚度为5mm）

磅

在1升蒸馏水中加入35克粉末
加热至沸腾，同时搅拌溶解粉末
在121℃高压灭菌15分钟以消毒
允许冷却至约50℃。倒入培养皿中，使其固化（厚度为5mm）

哥伦比亚5％血琼脂

这些琼脂板可从BD（见材料和试剂）可以使用

蔗糖溶液
15％和25％蔗糖溶液
4％多聚甲醛（500 ml）

在玻璃烧杯中取400毫升PBS，并在通风罩内保持搅拌板（多聚甲醛有毒）
加热溶液，同时搅拌至约60°C
向溶液中加入20克多聚甲醛粉末
为了溶解多聚甲醛粉末，缓慢加入1N NaOH直至溶液变澄清。冷却溶液并过滤，并用PBS将体积调节至500ml
用稀盐酸调节pH至6.9
将溶液等分，并在-20°C下冷冻并在2个月内使用

致谢

TM由德意志民主共和国（DFG）授权MI471/6-1提供支持。该协议最初是由Hagberg等人开发的。（1983），并在Cirl等人的出版物中进行了修改。（2008），Yadav等人。（2010）和Waldhuber等人。（2016）。作者声明，没有可能影响其协议的设计和实施的利益冲突或竞争利益。

参考文献

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Waldhuber，A.，Puthia，M.，Wieser，A.，Cirl，C.，Durr，S.，Neumann-Pfeifer，S.，Albrecht，S.，Rommler，F.，Muller，T.，Zheng，Y 。，Schubert，S.，Gross，O.，Svanborg，C.和Miethke，T。（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm.nih E.gov/pubmed/27214553"target ="_ blank"> Uropathogenic大肠杆菌菌株CFT073破坏了NLRP3炎性细胞活化。 J Clin Invest 126（7）：2425 -2436。
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