材料和试剂

管，薄壁，聚丙烯，13.2毫升（Beckman Coulter，目录号：331372）
9"巴斯德吸管（Kimble Chase Life Science and Research Products，目录号：883350-0009）
15毫升管子
Posi-Click 1.7-ml微量离心管（Denville Scientific，目录号：C2171）
ThermoGrid ^TM刚性条带0.2-ml PCR管[（Denville Scientific，目录号：C18064（1000859）]
MicroAmp ^®光学384孔反应板（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，目录号：4309849）}
MicroAmp ^®光学粘合膜（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，目录号：4311971）}
穿刺针
100毫米盘
溴酚蓝（BPB）（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
环己酰亚胺（CHX）（Sigma-Aldrich，目录号：C7698）
二甲基亚砜（DMSO）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：20012027）}
RiboLock RNase抑制剂（40U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：EO0381）}
TRIzol ^®试剂（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：15596018）
氯仿
异丙醇
GlycoBlue ^{TM共沉淀物（15mg/ml）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM9515）}}
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
无核酸酶水（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM9930）
随机引物（150ng /μl）（Sigma-Aldrich，目录号：11034731001）
dNTP混合物（每种10mM）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：R0193）}
Maxima逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：EP0741）
KAPA SYBR ^® FAST ABI棱镜2x qPCR主混合物（Kapa Biosystems，目录号：KK4605）或其他供应商的SYBR Green
EDTA
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S1888）
NaCl
Tris-HCl
MgCl 2
KCl
Nonidet P-40
DTT
5×RT缓冲液（250mM Tris-HCl [25℃下的pH8.3]，375mM KCl，15mM MgCl 2，50mM DTT，Maxima Reverse Transcriptase提供）
完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：11873580001）
2.2 M蔗糖（MW 342.3）（参见食谱）
10x盐溶液（参见食谱）
追逐溶液（60％蔗糖）（参见食谱）
环己酰亚胺（CHX）（1,000x）（参见食谱）
25x蛋白酶抑制剂（参见食谱）
多聚赖氨酸提取缓冲液（PEB）（见食谱）

设备

SW 41 Ti转子封装（Beckman Coulter，目录号：331336）
手动移液器（SP Scienceware - Bel-Art Products - H-B Instruments，目录号：F37911-1010）
细胞刮刀
Vortexer
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5430 R）
NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：ND-ONE-W）}
Optima ^{TM XE 90K - 制备型超速离心机（Beckman Coulter，目录号：A94471）}
分光光度计
PCR带管转子，迷你离心机C1201 [Denville Scientific，目录号：C1201-S（1000806）]
Veriti ^® 96孔热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，目录号：4375786）}
Eppendorf ThermoMixer ^® F1.5（Eppendorf，目录号：5384000012）
MPS 1000迷你板旋转器（翌日科学，目录号：C1000）
密度梯度分馏系统（Brandel，目录号：BR-188）
QuantStudio 5实时PCR系统，384孔（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，目录号：A28140）}

程序

蔗糖梯度的制备（表1）（注3和4）

表1.蔗糖储备溶液的制备
1. 准备表中提到的10％，20％，30％，40％或50％蔗糖的储备溶液，并将其储存在4°C直到使用。
2. 在多核糖分馏实验前一天准备蔗糖梯度，并在4℃预冷SW41Ti转子和桶过夜。
3. 使用含有10％，20％，30％，40％或50％蔗糖的制备溶液（见表1），首先向薄壁超速离心管的底部加入2.2ml 10％蔗糖梯度。
4. 使用9"巴斯德移液器和手动移液器（图1;注1），将每个后续层（每个2.2ml，分别为20％，30％，40％，然后50％）。
5. 将梯度保持在4°C过夜，使梯度变成线性（图2;注6和7）
6. 做一个高浓度的蔗糖溶液（请参阅食谱），这个高浓度的蔗糖溶液会将样品推入吸光度检测器，加入少许颜色的溴酚蓝（BPB）粉末斑点（观察样品与追踪之间的转换溶液）并在4℃下储存。
图1.蔗糖梯度准备示意图
细胞质裂解物制备
1. 在含有10ml培养基的细胞中加入10μl100mg/ml放线菌酮（CHX）的DMSO溶液，得到100μg/ml CHX，37℃孵育10分钟（注2）。
2. 取出培养基并用补充有100μg/ml CHX的冰冷PBS洗涤细胞三次。
3. 胰蛋白酶消化3分钟或足够长以使细胞从板上脱落或用细胞刮刀刮擦细胞，并用CHX的冷PBS将细胞转移到15-ml管中以冲洗板（注8）。
4. 通过在500×g下离心5分钟来造粒细胞。
5. 细胞沉淀物可以储存在-80°C或立即用于细胞质裂解液制备。
6. 通过吸取含有100μg/ml CHX，1×蛋白酶抑制剂和1：1,000稀释的RiboLock RNA酶抑制剂的0.5至1.0ml多聚糖提取缓冲液（PEB）来破坏细胞沉淀物。
7. 将细胞悬浮液转移到1.7微升的微量离心管中，并在冰上孵育10分钟，每两分钟偶尔反转（不要旋涡）。
8. 在4℃下以12,000xg离心10分钟以沉淀核和碎屑。
9. 将上清液（胞质裂解物）的总体积的约9/10转移到新鲜管中
10. 通过Bradford测定法测定蛋白质浓度和/或Nanodrop的总RNA浓度
11. 该上清液也可以储存在-80℃，再次分馏，或进行多分支分馏
多聚糖分馏
1. 小心地将等量的细胞质裂解物（含有1.0-1.5mg蛋白质或100-300μgRNA的1ml或更少）分层至10-50％蔗糖梯度的顶部。确保所有的管均衡。
2. 使用Beckman超速离心机，在最大加速度和制动下，在4°C下，以最大加速度和制动力，以190,000 x g（〜39,000 rpm）的SW41Ti摆动叶轮转子将梯度离心90分钟（图2）。
  
  图2.多聚体分馏示意图
3. 离心后将梯度保持在冰上。首先，将梯度放置在分馏系统上 - 穿刺针将穿刺管的底部。
4. 每个梯度收集1ml/min级分至12管，并立即将馏分转移到冰桶中
5. 分离系统光学单元内的254 nm分光光度计读取每个级分中的RNA量，并绘制显示梯度多聚体谱的图表（图3A;注5）。
6. 根据需要分析馏分，或将馏分储存在-80°C直至使用。
RNA和cDNA制备蔗糖梯度
1. 在新鲜的1.7-ml管中取0.5ml各蔗糖级分，加入0.5ml TRIzol和200μl氯仿。
2. 涡旋或剧烈振荡10秒，并在4℃下以13,000 x g离心15分钟。
3. 将500μl上层转移到含有1ml异丙醇和2μl15mg/ml Glycoblue的新鲜微量离心管中。
4. 通过在-20℃下孵育过夜沉淀RNA，然后在4℃下以13,000×g离心15分钟。
5. 弃去上清液，用1ml冰冷的70％乙醇洗涤沉淀一次
6. 在4℃下以13,000×g离心15分钟，弃去上清液。
7. 在4℃离心几秒钟，收集管底部剩余的乙醇
8. 在25℃下弃去乙醇和空气干燥的RNA颗粒5-10分钟
9. 将RNA溶解在12μl无核酸酶的水中（注9）
10. 通过制备含有12μl制备的RNA，1μl随机六聚体，4μl5x RT缓冲液，1μlRiboLock，1μldNTP混合物和1μlMaxima逆转录酶的20μl反应，使用整个RNA溶液进行逆转录。 />
11. 混合并离心几秒钟以使反应混合物在管底沉降。
12. 使用在25℃下设定10分钟，50℃30分钟和85℃5分钟的热循环仪进行cDNA合成。
13. cDNA产物可以在-20°C或-80°C保存，或立即用于RT-qPCR分析。
蔗糖梯度上mRNA分布的RT-qPCR分析
1. 用无核酸酶的水稀释cDNA（20μl体积）至最终体积为1,000μl
2. 为了扩增特异性转录物，在无核酸酶的水中制备终浓度为1μM的基因特异性正向和反向引物混合物。使用感兴趣的mRNA的引物组以及编码内切蛋白（例如，/或> ACTB mRNA或GAPDH mRNA）的1或2个mRNA。 br />
3. 在384孔板中准备20μlqPCR反应，加入10μl2x SYBR Green PCR混合液，5μlcDNA和5μl引物混合物。
4. 用光学粘合剂膜覆盖板，并以最大速度涡旋10秒以混合反应。
5. 使用Plate Spinner将板离心板30秒，以平衡孔底部的反应
6. 对于qPCR使用QuantStudio 5实时PCR系统，在95℃下设置3分钟，在95℃加5秒，60℃加20秒的循环。
7. 建议分析解离曲线以验证引物组是否为最佳
8. 使用周期阈值（CT）值，可以使用ΔCT方法（表2和3）计算跨越梯度的mRNA的百分比（％）分布。
  
  表2.对照细胞中蔗糖梯度的mRNA A分布比例
  
  表3.处理细胞中蔗糖梯度的mRNA A分布比例

数据分析

密度梯度分馏系统为每个样品产生多聚体谱，其中包括从轻到重级分的无核糖体物质的级分，以及具有40S，60S，80S（单体）和低分子量（LMW）和HMW）多核糖体。由于与图3A中的假想实例的对照相比，这些峰在处理的细胞中似乎并不显示不同，所以治疗似乎对全局mRNA翻译似乎没有重大影响。然而，跨越梯度的mRNA A的％分布显示，在含有对照样品的梯度的活性翻译级分（分数为8至10，跨越高分子量多核糖体）中，该mRNA最丰富（表2和图3B，实线）。在处理的细胞中，mRNA的分布在梯度上显示向左移动，并且在5至7级中最丰富（跨越低分子量多核糖体）（表3和图3B，虚线），表明mRNA A在细胞处理后与较小的多核糖体相关。这些数据与在没有全局mRNA翻译变化的处理细胞中mRNA A的翻译被抑制的概念一致（图3A和3B）。应该测量和编制类似的编码内部蛋白质（例如，/或> GAPDH mRNA或ACTB mRNA）的mRNA的分布（图3C;注10）。 GAPDH mRNA在分布模式中没有显示显着变化的事实支持下述治疗后mRNA A多核糖体的尺寸减小的概念（图3B和3C）。

图3.处理对蔗糖梯度上mRNAA分布的影响。来自对照和处理的细胞的细胞质裂解物通过蔗糖梯度分级。显示了由密度梯度分馏系统产生的全球RNA多聚体谱。 B.通过RT-qPCR分析RNA中的每一种，研究了在蔗糖梯度上编码持家蛋白质的％mRNA A（左）和GAPDH mRNA（右）的相对分布12个梯度分数。

笔记

缓慢加入蔗糖梯度层，不引入任何气泡
对于良好的多聚体峰，使用不超过80％汇合的一个100毫米皿的新鲜裂解物。太小的细胞将导致较小的峰值，也许低于检测器灵敏度设置。过度融合的细胞可能不具有主动翻译的增殖状态，因此多聚体峰不会显示为强壮的。
使用无核酸酶水或DEPC处理过的水用于所有缓冲液和溶液。
不要高压蔗糖。
不含细胞裂解物的10-50％蔗糖梯度的分级应产生一个直线平坦线的吸光度分布。如果轮廓产生斜线，则蔗糖本身有助于吸光度读数，并可能干扰实验裂解物中多聚体峰的分辨率。
梯度可在16到3天（4°C）使用。
线性梯度可以在-20°C或-80°C下冷冻2周（或更长时间），并在解冻后立即使用。
对于分化的细胞（神经元，肌肉）或衰老细胞，最好将PEB直接加入板中并刮擦细胞。
不要测量多聚体部分中的RNA浓度，因为它们的分数会有差异，有些部分RNA含量非常低
mRNA A与对照mRNA没有正常化RT-qPCR值。编码整理蛋白（例如，/或> GAPDH mRNA或ACTB mRNA）的mRNA被简单地处理以测试通用mRNA是否类似地分布不同治疗条件的梯度。
为了证实沿着梯度分级的mRNA确实与多核糖体相关，细胞裂解物可以在冰上装载之前与20mM EDTA一起在冰上孵育10分钟。与对照样品不同，EDTA处理的样品应不显示多核糖体峰，并显示单体和核糖体亚基的增加的峰。在EDTA处理的样品中，编码持续性蛋白质的mRNA和感兴趣的mRNA的分布不应该在多聚体部分中达到峰值，而应该在未结合和单体部分中积累，显示出向梯度的较轻部分的整体转移。 />

食谱

2.2 M蔗糖（MW 342.3）
753.06克蔗糖在1000毫升无核酸酶水中（注3和4）
储存于4°C
10x盐溶液
100 mM NaCl
20mM Tris-HCl（pH7.5）
5mM MgCl 2
储存于4°C
追逐溶液（60％蔗糖）
40 ml 2.2 M蔗糖 5ml H 2 O O
5 ml 10x盐溶液
溴酚蓝粉（BPB） - 可选
储存于4°C
环己酰亚胺（CHX）（1,000x）
储存溶液在二甲基亚砜（DMSO）中为100mg/ml 等分并储存于-20°C
25x蛋白酶抑制剂
将1片蛋白酶抑制剂溶解于2毫升无RNase的水中等分并储存于-20°C
多聚赖氨酸提取缓冲液（PEB）
20mM Tris-HCl（pH7.5）
100 mM KCl
5mM MgCl 2
0.5％Nonidet P-40
储存于4°C
在使用前将蛋白酶抑制剂，RNase抑制剂和100μg/ml CHX加入到PEB的等分试样中

致谢

这项工作得到了国立卫生研究院老龄化研究方案的支持。

参考文献

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