材料和试剂

细胞刮刀，40厘米手柄，16毫米刀片（Sigma-Aldrich，目录号：C6106）
塑料管50毫升锥形底座（114 x 28毫米）（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
塑料管15毫升锥形底座（120 x 17毫米）（SARSTEDT，目录号：62.554.002）
塑料管1.5毫升安全锁（Eppendorf，目录号：022363204）
玻璃微纤维过滤器，直径25 mm，Whatman级GF/C（GE Healthcare，目录号：1822-025）
闪烁塑料小瓶（Sigma-Aldrich，目录号：V6755）
显微镜载玻片（26 x 76 mm）（Sigma-Aldrich，目录号：Z692247）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
硫酸铵[（NH 4）2 SO 4]（Sigma-Aldrich，目录号：A4418）
蔗糖（Merck Millipore，目录号：107687）
1M氯化镁（MgCl 2）溶液（Sigma-Aldrich，目录号：M1028）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
1M Mn（II）氯化物（MnCl 2）溶液（Sigma-Aldrich，目录号：M1787）
鸟苷5'-三磷酸钠盐（GTP）（Sigma-Aldrich，目录号：10106399001）
腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物（ATP）（Sigma-Aldrich，目录号：A7699）
胞苷5'-三磷酸二钠盐（CTP）（Sigma-Aldrich，目录号：C1506）
尿苷5'-三磷酸三盐（UTP）（Sigma-Aldrich，目录号：U6875）
尿苷5'三磷酸酯[5,6-三羟基]四钠盐（³ H-UTP）（PerkinElmer，目录号：NET380250UC）
α-amanitin（Sigma-Aldrich，目录号：A2263）
液体闪烁混合物Hionic Fluor（PerkinElmer，目录号：6013319）
三氯乙酸（TCA）（Sigma-Aldrich，目录号：T4885）
高氯酸（PCA）65％w/w（10.35N）（CARLO ERBA试剂，目录号：306091）
氢氧化钾（KOH）（EMD Millipore，目录号：105033）
2-巯基乙醇（EMD Millipore，目录号：805740）
氟化钠（NaF）（Sigma-Aldrich，目录号：S7920）
PBS（pH 7.3）（参见配方1）
1M Tris-HCl溶液（pH 7.4或pH 8.0）（参见方法2）
3 M硫酸铵（见配方3）
均质溶液（参见配方4）
洗涤液（参见配方5）
悬浮液（参见配方6）
高离子强度5x反应混合物（见方案7）
核苷三磷酸酯混合物（参见食谱8）

非放射性溶液
放射性解决方案

α-淀粉蛋白重组（见方法9）
10％（w/w）TCA（见配方10）
0.6 N PCA（见配方11）
0.3 N KOH（参见配方12）
6 N PCA（见配方13）
7％（w/w）PCA（见配方14）
0.5 M NaF（见配方15）
低离子强度5x反应混合物（参见配方16）

设备

防护手套/防护服/眼睛保护/面部护理
离心机（Beckman Coulter，型号：TJ-25）
注意：本产品已停产。
特氟隆^®杵PYREX ^® Potter-Elvehjem组织研磨机（Thomas Scientific，目录号：1234F）
镊子
高速组织研磨机（均质机）（IKA，型号：Eurostar）
倒置显微镜（Zeiss，型号：Primovert，目录号：491206-0001-000）
10毫升玻璃管
水浴（JULABO，型号：SW22）
2000 ml滤瓶
分光光度计UV-VIS（CHROMSERVIS，型号：Nanogenius）
液体闪烁计数器（Guardian，Wallac，PerkinElmer）
用于25 mm圆盘过滤器的真空玻璃过滤器支架：玻璃漏斗，夹具，25 mm玻璃/过滤器支架底座和穿孔塞子（可从许多公司获得，例如：Sigma-Aldrich，目录号：Z290467; EMD Millipore，目录号码：XX1002500）
真空泵

程序

注意：实验采用放射性物质，操作人员需要个人和环境辐射防护和放射性废物管理经验。

细胞核分离
RNA聚合酶I活性可以在从培养的细胞系或新鲜或冷冻组织分离的细胞核中测量，在本文中描述了从培养细胞中分离细胞核的标准方法。
1. 在细胞培养瓶中培养需要的培养基中生长所需的细胞系，至少达到约50×10 6个细胞。
  注意：可以对细胞进行特殊处理，在特殊条件下生长或比较各种细胞系。
2. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中通过刮刀收集细胞，每10×10 6细胞使用10ml PBS，并将刮体细胞的体积收集在50ml塑料管中。
3. 从这一点上来说，一直保持细胞冷。
4. 在4℃以3,000×g离心10分钟以沉淀细胞。丢弃上清液。
5. 用20ml冷PBS洗涤细胞沉淀，然后在4℃以3,000×g离心10分钟，弃去上清液。
6. 将细胞悬浮在10ml匀浆溶液中，并用电机驱动装置用杵和陶器组织研磨机均质化破坏细胞质膜和细胞质：5次行程可能就足够了。
7. 让均匀的细胞在冰中静置10分钟
8. 此时检查细胞质膜是否分解，细胞核是否完整和细胞质无关。将大约10-20μl匀浆细胞载于载玻片上并用光学显微镜观察（图1）。如果需要，您可以重复均匀化步骤而不超过10次。
  
  图1.显示PLC整体和匀浆细胞的显微镜图像。 A。 PBS洗涤细胞;均质细胞。通过与图A比较，在B中观察到细胞质膜的破裂和细胞形态的丧失。细胞核明显而完整。箭头表示核周围的细胞质碎片，这些残留物可以通过洗涤去除。使用蔡司Primovert倒置显微镜。 200倍放大倍率。
9. 将均质化样品转移到管中，并在4℃以3,000×g离心10分钟以沉淀核并丢弃上清液中的任何细胞质残留物。通过加入5ml洗涤溶液洗涤细胞核，并在4℃以3,000×g离心10分钟。彻底清除上清液
10. 加入1ml悬浮液，移液混匀，取0.1ml悬浮核，转移至另一管中提取和定量水解DNA。使用剩余体积来测定体外 RNA聚合酶I活性。
RNA聚合酶I活性的体外评估
在α-淀粉样蛋白存在下使用高离子强度培养基来评估RNA聚合酶I.在高离子强度培养基中，RNA聚合酶I和II都是活性的，然而，RNA聚合酶II被α-amanitin抑制（Novello和Stirpe， 1970）每个样品的测量一式三份进行，并附有两个空白。
1. 准备10毫升玻璃管，每个管必须含有最终体积500微升。
  按以下顺序添加：
  100μl5x高离子强度缓冲液
  90μl核苷三磷酸盐混合物
  1微升1毫克/毫升的α-淀粉样溶液 MilliQ H 2 O至400μl
  100μl细胞核
  注意：添加细胞核作为最后一个元素，涡旋非常快，立即开始反应时间。
2. 将所有样品在37℃下在水浴中以100rpm摇动孵育10分钟。
3. 10分钟后，使用5毫升10％（重量/重量）的TCA停止反应并将管放在冰上。将管保持在冰上直到过滤步骤。
  注意：
新合成的rRNA收集和测量
TCA沉淀核酸分子，包括新合成的3 H-标记的rRNA，可以在玻璃纤维过滤器上收集并在液体闪烁计数器中测量。
1. 为了准备真空过滤，将一个2000毫升过滤瓶和一个25毫米圆盘过滤器的真空玻璃过滤器支架聚集在一起，使用真空管将过滤瓶的侧臂连接到真空泵。组装在底部放置湿玻璃微纤维过滤盘的设备（图2）。过滤盘用5％（w/w）TCA润湿。
2. 将样品倒入漏斗中，打开真空泵，直到整个样品通过过滤器和漏斗底座。用5％（w/w）TCA冲洗过滤器，每次冲洗10 ml洗涤5次注意：滤瓶中收集的液体中含有大部分放射性物质。
3. 关闭真空泵，取出漏斗并使用镊子将过滤器放入含有10ml闪烁液的闪烁塑料瓶中。
4. 对每个样品管重复步骤C2和C3。
5. 大力摇动小瓶，将其放入液体闪烁计数器中，以测量样品的放射性。
  
  图2.过滤系统的装配 A和B.装置部件：过滤烧瓶（1），玻璃微纤维过滤盘（2），漏斗（3），玻璃支撑基座（4）穿孔止动器（5），镊子（6）和夹具（7）。 C.带有玻璃支撑底座的塞子插入烧瓶开口。 TCA湿玻璃微纤维过滤器放在基座上。 D.将漏斗放在过滤器上并用夹具停止。过滤瓶的侧臂通过真空管连接到真空泵。
核DNA提取和定量
以下程序是基于Munro和Fleck（1966年）报道的。
1. 使用0.1ml悬浮核提取并定量水解的DNA
2. 收集0.1ml细胞核并将其转移到10ml玻璃管中
3. 加入0.5ml 0.6N高氯酸（PCA），将样品涡旋几秒钟，并在4℃以3,000×g离心10分钟。去除并丢弃含有单核苷酸和寡核苷酸的上清液，不包含在可溶于弱酸溶液的DNA和RNA分子中。保持含核RNA分子和DNA的沉淀。
4. 加入0.5ml的0.3N氢氧化钾（KOH）沉淀，涡旋样品，并在37℃，水浴中，振荡孵育30分钟，水解RNA。注意：在碱性环境中，RNA易于进行碱催化水解，而DNA是化学稳定的。
5. 加入50μl6 N PCA溶解核糖核苷酸并沉淀仍然存在的大分子。在4℃下以3,000×g离心10分钟，弃去含有水解RNA的上清液，并保留含有DNA的沉淀物。
6. 加入0.5ml 7％（w/w）PCA，旋转样品悬浮并在70℃下在水浴中振荡孵育15分钟，将DNA水解成脱氧核苷酸。
  注意：酸溶液和加热释放脱氧核苷酸，可在离心后在上清液中回收。
7. 在4℃以3,000×g离心10分钟。将含有水解DNA的上清液转移到1.5 ml管中
8. 使用260nm波长的分光光度测量来定量水解DNA的量。
9. 计算DNA浓度，将260nm处的吸光度乘以20mm路径长度归一化因子20：
  DNA（μg/ml）=（OD 260nm/NF）×20
  哪里，
  OD 260nm（光密度）：指示波长处的吸光度，
  NF（归一化因子）：归一化为10mm路径长度的因子，例如，如果路径长度为1mm，则归一化因子为10，
  因子20：1在260nm处的OD对应于寡核苷酸的约20μg/ml

数据分析

RNA聚合酶I活性通过掺入新合成的rRNA中的放射性测量来表示，以每分钟的崩解（dpm）表示。每个细胞样品一式三份进行评估。

计算空白的dpm平均值。
从每个复制样本中减去空白平均值。
将结果除以先前量化的DNA，并计算平均值和标准偏差。平均值以dpm /μgDNA表示。

假设DNA量与细胞核数量成正比，结果表示每个细胞核RNA聚合酶I新合成的3H标记rRNA的量。

代表数据

下面描述RNA聚合酶I活性测量的实例。获得了两种人类癌细胞系HCT11和LoVo中酶活性的代表性数据。如Scala等人（2016）报道的，这些细胞系的特征在于不同水平的rRNA合成，并具有不同的细胞周期长度。

图3显示了液体闪烁计数仪器的放射性测量值的输出

图3.通过读取液体闪烁计数器（Guardian，Wallac，PerkinElmer）中的样品获得的放射性值的图片。 放射性值以dpm表示。 1-5：HCT116样品; 6-10 Lovo样品。蓝色圆圈包围两个空白，而红色圆圈对应于通过RNA聚合酶I掺入到合成的rRNA分子中的³ H尿苷5'-三磷酸含量的放射性测量。仪器提供每分钟崩解（dpm）和每分钟计数（cpm）;每分钟的计数是仪器从源头接收的计数。
在表1中，数据分析逐步显示。一旦获得了放射性测量值，则计算每个空白的dpm均值，并从各自的重复中减去。将结果除以存在于0.1ml核中的DNA的μg。然后，计算标准化为1μgDNA的空白减去dpm值的平均值和标准偏差。所有数据都使用Microsoft Excel程序处理。

表1.数据分析一步一步。该表报告在Excel程序（Microsoft Excel）的工作表中分析的数据。处理的所有数据均为粗体。标准化为1μgDNA的放射性值的方法为红色。按照核DNA提取和定量段中的指示计算0.1ml核悬浮液中的DNA含量
在图4中，最终结果以直方图报告，这使得两种癌细胞系中由RNA聚合酶I新合成的3H标记的rRNA的量不同。

图4.来自表1的代表性数据的直方图。直方图显示最终结果：将由RNA聚合酶I新合成的rRNA中并入的H-尿苷5'三磷酸盐归一化为1μgDNA（dpm /μgDNA）。数据显示为平均值±标准偏差。

食谱

PBS（pH 7.3）
8.00克NaCl
0.20克KCl
1.44g Na 2 HPO 4
0.24g KH 2 PO 4
溶于800毫升ddH 2 O -/- 用HCl将pH调节至7.3，并加入ddH 2 O至最终体积为1升（重量）终浓度：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na 2 HPO 4，1.8mM KH 2 PO 4， sub>
1M Tris-HCl溶液（pH 7.4或pH 8.0）
12.11克Tris碱
溶解在80毫升MilliQ H< 2> O
中用适当体积的浓HCl调节pH至7.4（或pH 8.0）将MilliQ H 2 O 2添加到最终体积为100ml的
中
3 M硫酸铵
39.64克硫酸铵
溶解在80毫升MilliQ H< 2> O
中将MilliQ H 2 O 2添加到最终体积为100ml的
中
均质化解决方案
8.56克蔗糖
溶于50ml的ddH 2 O -/- 加入1ml 1M Tris-HCl pH 7.4（参见方案2），1ml 1M MgCl 2和0.5g Triton X-100
将ddH ₂ O添加到最终体积为100 ml 最终浓度：0.25M蔗糖，10mM Tris-HCl pH 7.4,10mM MgCl 2，0.5％Triton X-100
洗涤液
注意：此解决方案与不含洗涤剂的均质溶液相同。
8.56克蔗糖
溶于50ml的ddH 2 O -/- 加入1ml 1M Tris-HCl pH 7.4，1ml 1M MgCl 2
将ddH ₂ O添加到最终体积为100 ml
悬架解决方案
4.28克蔗糖
溶解在40ml的ddH 2 O中加入50μl的1M MgCl 2，并用ddH 2 O→
达到50ml终体积最终浓度：0.25M蔗糖，1mM MgCl 2
高离子强度5x反应混合物
2.5 ml 1M Tris-HCl pH 8.0（参见方法2）
0.1ml 1M MnCl 2（参见试剂18）
2.0 ml 3 M硫酸铵（见配方3）
0.4ml MilliQ H 2 O O
酶测定中的最终浓度：0.1M Tris-HCl（pH 8.0），4mM MnCl 2，0.24M硫酸铵
核苷三磷酸盐混合物
用放射性溶液混合非放射性核苷三磷酸溶液，比例如下所示。

非放射性溶液：
14.4毫克GTP
12毫克CTP
13.5毫克ATP
0.48毫克UTP
溶解于2.5毫升MilliQ H 2 O -/-

放射性解决方案：
50μCi的³将H-UTP稀释在
中 0.5毫升MilliQ H< 2> O

酶测定中的最终浓度：0.5mM GTP，0.5mM CTP，0.5mM ATP，0.02mM UTP和0.5μCi H-UTP
α-amanitin重组
1毫克/毫升α-淀粉酶水溶液储存于-20°C 注意：您可以存储很长时间。它不会随着反复冻融循环而退化。
10％（w/w）TCA
在100g ddH 2 O中稀释10g浓缩的TCA（≥99％w/w）
0.6 N PCA
稀释2.9ml 65％（w/w）高氯酸在50ml ddH 2 O中的溶液。
0.3 N KOH
将0.842g KOH溶解在50ml ddH 2 O中
6 N PCA
将29ml 65％（w/w）PCA稀释在50ml ddH 2 O中，
7％（w/w）PCA
在50g ddH 2 O中稀释5.39g的65％（w/w）PCA。
0.5 M NaF
将0.3g NaF溶解在10ml MilliQ H 2 O
中
低离子强度5x反应混合物
2.5 ml 1M Tris-HCl（pH 8.0）（参见方法2）
0.1 ml 1M MgCl 2（见试剂16）
18μl2-巯基乙醇（14M）
0.3 ml 0.5 M NaF（见配方15）
2.082ml MilliQ H 2 O
酶测定中的最终浓度：0.1M Tris-HCl（pH 8.0），4mM MgCl 2，50μM2-巯基乙醇，6mM NaF
注意：使用低离子强度介质时，α-淀粉蛋白不是必需的，因为空白可能太高，所以推荐体积减小的核苷三磷酸盐混合物（30μl）。

致谢

这个协议是从Novello和Stirpe的研究文章（1970）改编的。 Roberto和Cornelia Pallotti的遗传癌症研究得到了支持。作者感谢Massimo Derenzini教授有机会描述这个协议，并提供帮助和建议。作者还感谢Christine M. Betts博士对手稿的修订。作者声明没有利益冲突。

参考文献

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