材料和试剂

Fisherbrand无菌100 x 15 mm聚苯乙烯培养皿（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
15ml锥形管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
无菌单独包装5ml移液器（SARSTEDT，目录号：86.1253.001）
组织培养24孔板（SARSTEDT，目录号：83.3922.300）
Samco ^{TM超长转移移液管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：262）}
13 mm，0.8μmNucleopore Track-Etch膜（GE Healthcare，目录号：110409）
Kimwipes（Kimberly-Clark Worldwide，目录号：34120）（不经高压灭菌，但保持清洁）
Superfrost Plus Micro幻灯片（VWR，目录号：48311-703）
标准显微镜幻灯片盒（希思罗科学，目录号：HEA15991A）
微盖玻璃（VWR，目录号：48404-454）
4 in x 250 ft Parafilm roll（Bemis，目录号：PM999或VWR，目录号：52858-032）
50毫升康宁管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
0.22μm灭菌过滤器过滤（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
60 ml注射器（Medtronic，目录号：8881560125）
快速流动^{TM无菌一次性瓶顶过滤器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：291-4520）}
E15.5 CD1小鼠（Charles River Laboratories International，目录号：022）（见注1）
p ten ten ten;;;;;;;;;;;;;;; pax6-Cre ⁺ 或 Pten ^+/+ 鼠标（见注2）
1×Ca 2+ +/sup>/Mg 2+无自由DPBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190250）}
台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15250061）
Aquapolymount（Polysciences，目录号：18606）
胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T1005）
热灭活的FBS（胎牛血清）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：12484028）}
DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11965092）
1x HBSS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：24020117）
热灭活马血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：26050088）}
200mM L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630080）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
两性霉素B（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15290026）
5-溴嘌呤（BrdU）（Sigma-Aldrich，目录号：850187）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
氯化钾（KCl）（EMD Millipore，目录号：PX1405）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5379）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
结晶PFA（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）
11.8M盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐（DAPI）作为如制造商（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：D1306）所述使用的预制的工作溶液，
抗Pax6和BrdU的抗体（见配方，表1）
Pax6（BioLegend，目录号：901301）
BrdU（Bio-Rad Laboratories，目录号：OBT0030）
驴抗兔Alexa-Fluor 488（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：A-21206）
山羊抗大鼠Alexa Fluor 568（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：A-11077）}}
最佳切割温度复合（VWR，目录号：95057-838）
2.5％胰蛋白酶（见食谱）
0.125％胰蛋白酶（见配方）
视网膜外植体介质（REM）（见配方）
1 mg/ml BrdU（见配方）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
1x磷酸缓冲盐水（PBS）（见配方）
20％多聚甲醛（PFA）（见配方）
4％多聚甲醛（PFA）（见配方）
20％蔗糖（见食谱）
2 N盐酸（见食谱）
1x磷酸盐缓冲盐水/0.1％Triton X-100（PBT）（参见食谱）
阻塞解决方案（见配方）

设备

Dumont镊子＃5（精细科学工具，目录号：11252-20）
杜蒙镊子＃55（精细科学工具，目录号：11255-20）
Dumont镊子AA（精细科学工具，目录号：11210-20）
浅水摇晃水浴（Precision Scientific，目录号：66799）
移液泵（SP科学软件 - 贝尔艺术产品 - H-B仪器，目录号：F37898-0000）
37℃，5％CO 2水夹套培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：3110）}
15ml角管的冷藏台式离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
血细胞计数室（Hausser Scientific，目录号：3100）
P20移液器（Gilson，目录号：F123600）
P200移液器（Gilson，目录号：F123601）
P1000移液器（Gilson，目录号：F123602）
冷冻机（Leica Biosystems，型号：CM3050 S）
-20°C冷冻机
直立荧光显微镜（Leica Microsystems，型号：DM RXA2）
高压灭菌器
1升烧杯（Corning，Pyrex ^®，目录号：1395-1L）
500ml烧杯（Corning，Pyrex ^{®，目录号：1395-500）}
250ml锥形烧瓶（Corning，Pyrex ^{，目录号：4450-250）}
通风柜
立体显微镜用于解剖（Leica Microsystems，型号：MZ6）
倒置光学显微镜（Leica Microsystems，型号：DMIL LED）

软件

GraphPad Prism（GraphPad软件）

程序

注意：

在实验前，预热0.125％胰蛋白酶和REM（见配方）至37°C。
这种方案是在没有无菌技术的情况下进行的，但我们非常小心，以尽可能地保持细胞和设备的清洁。

分离E15.5小鼠视网膜
1. 在室温从E15.5 CD1胚胎中取出眼睛（见注1关于小鼠）
2. 将眼睛放在培养皿中，然后加上1×DPBS以覆盖（图1A）
3. 使用Dumont镊子＃55和＃5（图1B）从眼睛中去除视网膜色素上皮（RPE）和晶状体（见附注4）。要删除RPE，用Dumont镊子＃55抓住一小块巩膜，然后用Dumont镊子＃5刺入巩膜以引起切口。用镊子研磨切口的边缘，并缓慢撕开切口。继续打开切口，直到去除巩膜，角膜和视神经。 RPE应与角膜一起脱离视网膜（视频1）。保持眼睛冷1×DPBS帮助RPE脱离。使用镊子从视网膜上取下睫毛边缘。这会松开视网膜上的镜片附件。轻轻拉出镜头（视频2）。为每个眼睛解剖替换1x DPBS，以保持培养皿和缓冲液冷。
  
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  视频1.从眼睛中删除RPE
  
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  视频2.从眼睛中取出镜头
  
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4. 将视网膜转移到15ml康宁管中（室温下用10ml的DPBS）（图1C）。让视网膜沉入管底部。（我们建议收集〜20个视网膜[10个胚胎的2只眼睛]，这样可以获得约8.0×10 6个细胞。）
5. 使用5ml移液器移除尽可能多的1x DPBS。确保不要移出视网膜组织。
6. 向视网膜中加入100μl0.125％胰蛋白酶（预温至37℃），并在37℃水浴中孵育10分钟（图1D）。请注意，视网膜本身不会分开。破碎细胞间相互作用是必需的。
7. 加入5毫升20％FBS/1×DPBS以停止胰蛋白酶消化
8. 通过使用5ml移液管（图1E），使用5ml移液管（图1E）将上下移动数次（，至少30次）进行均质化，使视网膜细胞完全均匀宏观观察细胞簇。确保轻轻地研磨以避免任何气泡，因为气泡会破坏细胞。我们建议使用移液泵来确保研磨温和。（视频3）（见注5）
  
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  视频3.研究胰蛋白酶消化的视网膜细胞
  
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9. 以520 x g旋转细胞5分钟，然后尽可能多地除去溶液。
10. 将细胞重新悬浮在1ml REM（预热至37℃）中
11. 将3μl1 mg/ml BrdU加入细胞再悬浮液中。涡旋温和地短暂混合。
12. 在水夹套培养箱中，37℃，5％CO 2孵育细胞1小时。
分离P2鼠视网膜
1. 以520 x x 旋转5分钟，尽可能多地移除解决方案。
2. 用1ml REM重新悬浮细胞（预热至37℃）
异位细胞沉淀的制备
1. 在BrdU孵育1小时后，从培养箱中取出E15.5 CD1解离细胞
2. 以520×g旋转细胞5分钟，尽可能多地除去培养基，然后在1ml REM中重新悬浮。重复此步骤两次以完全删除任何BrdU痕迹。将细胞重新悬浮在1ml REM（预热至37℃）中
3. 对于E15.5和P2细胞，取10μl细胞再悬浮并与10μl台盼蓝混合。使用血细胞计数器计算每个细胞再悬浮液的浓度（计算如图2所示）。确保细胞完全解离（即，，没有细胞团或双峰）。如果你看到任何一个块，我们建议重新解离单元格。
4. 在REM中稀释E15.5细胞重悬浮至1×10 6细胞/ml。将1×10 6细胞（1ml）分批加入15ml Corning管中作为对照。将E15.5细胞再悬浮稀释至0.5×10 6细胞/ml。
5. 在REM中稀释P2细胞重悬浮至1.0×10 6细胞/ml。将等分试样1×10 6细胞（1ml）加入15ml康宁管中。从E15.5 CD1细胞再悬浮液中加入0.5μl10μg/ml细胞的100μl（5.0×10 4个细胞）。用移液器泵用5ml移液管上下移动数次，彻底混匀。
6. 以520×g旋转5分钟，然后在300×g下旋转3分钟以沉淀异源细胞混合物（图1F）。
培养（视频4）
1. 24孔平板每孔1.5毫升REM。
2. 用剪刀切割超长移液管的尖端，然后点燃切割部位以使表面光滑。这样可以防止颗粒破坏，细胞粘附在移液管表面
3. 在旋转异源细胞聚集体（来自步骤C6）之后，通过用P1000移液管取出一些液体来从管的底部排出骨料。轻轻地将液体重新分配到颗粒边缘的管中，以便去除颗粒（参见注释6和7）。
4. 将干燥的Nucleopore Track-Etch膜置于无菌培养皿盖上的灭菌Kimwipe上。将杜蒙镊子AA的尖端放在膜的边缘，以防止细胞沉积物转移时膜的滚动。
5. 将转移细胞沉淀物用超长的转移移液管移至干燥的Nuclepore Track-Etch膜的中心（图1G）。请注意，将颗粒放在膜的中心是非常关键的。如果颗粒滴在膜的边缘，您可能会丢失细胞团块，因为它将流向Kimwipe并远离膜。 Kimwipe应吸收只留下薄膜上的颗粒的液体。
6. 通过将膜放置在灭菌的Kimwipe上进一步干燥膜。不要在膜上留下液体痕迹，因为会增加介质中膜下沉的可能性，这将导致细胞死亡。
7. 使用Dumont镊子AA将细胞沉淀物的边缘抓住，并轻轻地将其置于24孔板的一个孔中的REM表面上（图1H）。确保膜在介质上浮动，并且不会沉没，因为如果浸没，颗粒中的细胞会死亡。
8. 在37℃，5％CO 2孵育细胞聚集体8天，在体外（DIV）。每隔一天更换1/2的介质（750μl）。请注意，将膜从不浸没是至关重要的，因此在将板转入和移出培养箱时需要格外小心。
  
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  视频4.将异源细胞聚集体转移到膜上
  
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细胞收集和分析
1. 将REM替换为1 ml 1x DPBS，以清洗聚集体。用1x DPBS冲洗两次以清除痕量的REM。确保细胞颗粒不会从膜上移出。
2. 尽可能多地除去1个DPBS，然后加入500μl的4％PFA。在4°C固化骨料过夜。请注意，某些抗体可能需要较短的固定时间。
3. 用1x PBS洗涤聚集体三次，持续10分钟，然后浸入20％蔗糖/1×PBS中4℃冷冻保护过夜。
4. 将聚合物在膜上嵌入光学切割温度复合物（OCT）中并在干冰上冷冻（图3）。膜应垂直于模具的底部嵌入，以通过视网膜产生径向截面。我们建议将复制聚合嵌入到同一个块中。
5. 在10微米的低温恒温器上部分聚集，并收集Superfrost Plus载玻片上的部分。我们通常每个幻灯片收集大约七个部分，每个块最多可以有50个幻灯片。将幻灯片放入标准显微镜幻灯片盒中。幻灯片可以直接免疫染色或储存。对于存放，带有胶带的胶带滑动盒完全关闭并防止水分进入。储存于-20°C冰箱。
免疫染色
1. 打开前，将滑块放入室温30分钟，然后取出幻灯片。
2. 将载玻片置于预热的2N盐酸中，37℃下孵育20分钟
3. 在蒸馏的H 2 O 2中漂洗载玻片几次以除去尽可能多的盐酸。
4. 在1x PBS中洗涤3次5分钟，以平衡载玻片的pH
5. 从1x PBS中取出载玻片，并在纸张边缘上涂抹纸巾，以清除多余的液体。
6. 每个载玻片应用400μl封闭液（10％马血清/1×PBT），室温孵育1 h。确保阻塞解决方案彻底传播，以覆盖幻灯片的整个表面。
7. 去除尽可能多的封闭溶液，然后应用200μl在封闭溶液中稀释的一抗（参见表1进行稀释），并将Parafilm覆盖载玻片的整个表面。在4℃下孵育过夜。
8. 在1x PBS中洗三次，10分钟。
9. 应用200μl二抗（见表1）和稀释于1×PBT（分别为1:500和1:500稀释）中的DAPI，并将Parafilm放在顶部以覆盖溶液。在室温下孵育1小时。避免在光照下孵化，因为荧光是敏感的
10. 在1x PBS中洗三次，10分钟。
11. 应用水上安装和安装与盖玻片。
12. 用直立荧光显微镜拍摄视网膜细胞聚集体的几个图像（3个或更多）（图1I）。

数据分析

对于实验设计，为了比较两个数据集，我们进行沉淀测定至少三次。为了比较三个或更多的数据集，我们至少执行四个实验。对于每个实验，我们至少使用三次重复。对于每个重复，我们分析3-10个显微照片，以便计数至少500 BrdU ⁺细胞。
为了进行数据分析，为了评估BrdU标记的视网膜祖细胞的命运，我们从每个颗粒中分析了最少3次冷冻切片（图4A和4B）。我们拍摄每个免疫染色冷冻切片的显微照片，并计数表达细胞类型特异性标记物的BrdU ⁺细胞总数和BrdU ⁺细胞数。对于无长角细胞，作为示例，我们使用Pax6作为细胞类型特异性标记（图4A）。分化为Pax6 ⁺无长角细胞的BrdU ⁺祖细胞的百分比由下式计算：％Pax6 ⁺ BrdU ^{/sup>/BrdU ⁺单元格（如Tachibana 等等，2016）。}
对于统计分析，我们使用GraphPad Prism。要比较两个数据集，我们执行学生的测试。为了比较三个数据集，我们执行单因素方差分析和事后Tukey校正（如Tachibana ，2016）。

图1.视网膜/视网膜细胞在方案不同时间点的代表性图像。 A. E15.5摘除后眼睛; B.E15.5视网膜去除RPE后; C. E15.5视网膜沉入15 ml康宁管底部; D.在37℃水浴中对视网膜进行胰蛋白酶处理10分钟;解离的视网膜细胞。 F.异位视网膜细胞聚集体沉淀在15毫升康宁管（箭头）的底部; G.放置在膜上的细胞沉淀（用红色虚线勾画）; H.放置在REM表面上的膜上的细胞沉淀（侧视图）;用BrdU（红色）和无长角细胞标记Pax6（绿色）标记的聚集体。 le：镜片，re：视网膜，RPE：视网膜色素上皮

图2.使用血细胞计数器计算细胞再悬浮浓度的公式。注意，稀释因子为2，细胞再悬浮液用台盼蓝稀释（10μl+ 10μl）。

图3.嵌入OCT后膜和模具中异质细胞聚集体的取向

图4. Pax6的数据处理和分析 ⁺ BrdU ⁺ 细胞。 A.用于Pax6和BrdU的联合免疫染色的颗粒的冷冻切片的高倍放大图。箭头/箭头指向BrdU ⁺单元格（箭头;左），Pax6 ⁺单元格（白色箭头;中间）和Pax6 ⁺ BrdU ⁺单元格（蓝色箭头;右）。 B.我们如何处理数据的代表性形象。 BrdU ⁺和Pax6 ⁺ BrdU ⁺细胞从每个颗粒的多个部分（至少三个切片）计数，其至少在一式三份我们结合来自每个重复的所有部分的数据，并将其视为N = 1。为了避免偏见，我们从不同父母的不同细胞重复实验至少三次。

笔记

CD1雄性和雌性小鼠交叉，胚胎分期考虑早晨，阴道塞被检测为E0.5。 E15.5 CD1胚胎，例如，在
后15天收集插头的一天。
ten ten ten ten;;;;;;;;;;;;;;;;;; Pax6-Cre ⁺ 或 Pten ^+/+ 鼠标是通过跨越Pten ^fl/+ 女用Pten ^fl/+ ; Pax6-Cre ⁺ 男性，考虑到小狗出生于P0的那一天。 P2胚胎在出生当天后2天收集。
如果使用不同的小鼠品系，则不需要对协议进行更改。
当从眼睛中取出RPE和镜片时，非常重要的是不会损伤视网膜，因为您可能会丢失一些细胞。虽然P2眼睛的眼睛大于E15.5，但在宏观水平上，E15.5和P2眼睛除大小外没有明显的差异。因此，从视网膜中去除RPE和镜片的步骤保持不变。
虽然视网膜容易与胰蛋白酶解离，但其他细胞类型可能不会很容易解离。在这种情况下，可以测试其它试剂的解离（例如，胶原酶，木瓜蛋白酶，TrypLE TM）。细胞过滤器可用于去除团块，作为难以解离的组织的替代品。
当制作聚集颗粒时，我们强烈建议每个样品至少进行五次重复，因为您可能会在培养过程中（例如，如果它们沉没）会损失颗粒。这将允许您对每个实验至少有三个复制控件，这应该提供实验变异性的良好指示
当从15毫升管的底部移除颗粒时，不要施加太大的力，因为它很容易分离颗粒。我们通常使用P1000移液管吸取500μl液体，并在颗粒边缘缓慢分配液体。你应该看到颗粒浮在液体中，然后很容易拿起。

食谱

2.5％胰蛋白酶（40ml）

称取1 ml胰蛋白酶粉末在50ml管中，并加入40 ml 1x DPBS
旋转直至溶液完全溶解
过滤消毒（0.22μm），等分并储存于-80°C
使用1x DPBS将溶液稀释至0.125％（使用前先清新）

20％FBS/1x DPBS（10ml）（使用前先清）
在8ml 1x DPBS中，加入2ml FBS
过滤灭菌（0.22μm），并在室温下保存
视网膜外植体培养基（REM）（50ml）
添加所有组件：
25 ml DMEM
12.5 ml HBSS（1x）
12.5 ml热灭活马血清
50μlL-谷氨酰胺（200 mM）
300μlHEPES（1 M）
500μl青霉素 - 链霉素（100x）
100μl两性霉素B
过滤消毒（0.22μm），并在4°C下储存多达1个月
1mg/ml BrdU（10ml）

称取10毫克BrdU在15毫升管中，并加入10毫升1x DPBS

旋转直至粉末完全溶解

等分并储存于-20°C
10倍磷酸缓冲盐水（PBS）（2升）

混合163.6g NaCl，23g Na 2 HPO 4，3.7g KCl，4.06g KH 2 PO 4，

带蒸馏H 2 O 2/2的2升

在121°C高压灭菌20分钟

10倍PBS在室温下保存至1年

用蒸馏的H 2 O稀释至1倍，并将工作溶液的pH值调节至7.5

1x PBS可以在室温下保存3个月以上
20％多聚甲醛（PFA）（200ml）

在烧杯中称量40 g结晶PFA，加入200 ml 1x PBS

加热溶液直到粉末完全溶解至65°C（不高于PFA会降解）

等分并储存于-20°C

用1x PBS稀释至4％，并将工作溶液的pH调至7.5（使用前先清新）
20％蔗糖（500ml）

在烧杯中称量100g蔗糖，并加入500 ml 1xPBS

加热溶液并轻轻混合，直至粉末完全溶解

过滤消毒（瓶顶），并在4°C下储存6个月
2N盐酸（118ml）（使新鲜）

在烧瓶中测量98ml蒸馏的H 2 O 2，并在通风橱中轻轻加入20ml盐酸。

在BrdU免疫染色之前预热至37°C
1x磷酸缓冲盐水/0.1％Triton X-100（PBT）（2L）

用蒸馏的H 2 O（1,800ml）稀释10倍的PBS（200毫升）至1倍。

加入2ml Triton X-100并调节pH至7.5

该溶液可以在室温下保存长达2周
阻塞溶液（10％马血清/1×PBT）（5ml）（使用前使新鲜）
将500μl马血清分成15ml管，加入4.5ml 1x PBT 涡旋混合彻底
将初级抗体以封闭溶液稀释，如表1中所述
二抗在PBT中稀释1/500。 DAPI预制商业解决方案以1/500添加。第二抗体列于表1中
表1.主要和次要抗体列表

致谢

这项工作得到了加拿大脑力量大学和加拿大大学以及加拿大希思研究所（CIHR）（拨款号89994）和狮子会视觉中心的支持。 CS是Sunnybrook研究所眼科研究中的Dixon家庭主席。新罕布什尔州得到艾伯塔省儿童医院研究所（ACHRI）-CIHR奖学金的支持。该方案根据Tachibana等人发表的程序进行了改进。（2016）和Ma等人（2007）。

参考文献

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