材料和试剂

Nunc ^{TM细胞培养处理的EasYFlasks ^{TM（75cm 2，过滤器封闭）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM >，目录号：156499）}}}
Falcon管（15毫升）（VWR，目录号：734-0451）
提示
Falcon管（50ml）（VWR，目录号：734-0448）
Eppendorf管（1.5ml）（VWR，目录号：211-2520）
（6孔）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：140675）的Nunc ^TM细胞培养处理的多片}
盖板（22mm，厚度No.1）（VWR，目录号：631-0158）
注射器（20 ml，VWR，目录号：613-3921）
过滤灭菌器（0.2μm，VWR，目录号：514-0064）
MDA-MB-231细胞（ATCC，目录号：HTB-26）
先进的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（500ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：12491023）}
胎牛血清（FBS，热灭活，50ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10500064）}
（5ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：35050061）}
青霉素 - 链霉素（10,000U ml -1），5ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
胰蛋白酶-EDTA（0.25％，酚红，100ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200056）}
FCCP（10mg）（Sigma-Aldrich，目录号：C2920）
鱼藤酮（5g）（Sigma-Aldrich，目录号：R8875）
乙醇（1L）（Sigma-Aldrich，目录号：02860）
Dulbecco改良的Eagle's中等粉末（无葡萄糖，L-谷氨酰胺，酚红，丙酮酸钠和碳酸氢钠）（Sigma-Aldrich，目录号：D5030）
D-（+）葡萄糖（100g）（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
丙酮酸钠（25g）（Sigma-Aldrich，目录号：P2256）
HEPES（100g）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氢氧化钠溶液（1N，1L）（Sigma-Aldrich，目录号：71463）
盐酸溶液（1N，1L）（Sigma-Aldrich，目录号：71763）
常规细胞培养基（500毫升）（见配方）
活细胞成像培养基（50ml）（参见食谱）
ETC扰动（见配方）

设备

培养箱（37℃，5％CO 2）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，superson TM，型号：HERAcell ^{TM 150） >}
离心机配有15 ml Falcon管容量（Mega Star 1.6）（VWR，目录号：521-1749）
血细胞计数器（Neubauer）（VWR，目录号：630-1509）
激光扫描显微镜（Zeiss，型号：LSM510）
1. 40倍放大目标
2. 遮阳窗帘，房间和覆盖FLIM显微镜（见图2）
  
  图2.高信噪比FLIM的设备。 A.具有双光子激发的相干变色龙的蔡司LSM510和Becker& Hickl HPM-100-40检测器和SPC830计数电子元件。 B.显微镜室和显微镜本身周围的遮光窗帘，用于确保FLIM影像中的背景噪音保持在最低水平。
3. NAD（P）H荧光发射滤光片（435-485 nm）
4. 对于单光子激发：
  1. 351 nm激光源（Enterprise UV，Coherent）
  2. 长通二色（375 nm截止）
  3. 石英显微镜光学
5. 对于双光子激发：
  1. Ti：蓝宝石激光器以720nm模式锁定（Chameleon Ultra，Coherent）
  2. 短路二色（650nm截止）
  3. 非下行检测
6. 对于FLIM：
  1. 具有单光子灵敏度的检测器（Becker& Hickl，型号：HPM-100-40）
  2. 时间相关单光子计数（TCSPC）电子学（Becker& Hickl，型号：SPC-830）
  3. 脉冲激发源（双光子激发由Ti：蓝宝石激光器在720nm;变色龙Ultra，Coherent）
7. 加热显微镜台（定制保持成像环，见图3）
  
  图3.用于在显微镜上安装盖玻片的设备。 A.定制环和用于固定22毫米圆形盖玻片的安装块。 B.盖片直接放在金属环的底部上。 C.具有橡胶密封件的同心环放置在盖玻片的顶部。 D.将第三个环拧到前两个上，以便在盖玻片上形成防水密封，允许（E）成像缓冲液移液到细胞上。 F.成像环和细胞然后适合加热显微镜阶段。
直头钳（VWR，目录号：232-0094）
成像环（定制，见图3）
倒置相位对比度台式显微镜（VWR，目录号：630-2145; ZEISS，型号：Primovert）
实验室平衡（0.1mg分辨率）（Mettler-Toledo，目录号：30029067）
pH计（Mettler-Toledo International，目录号：30266626）
计数器（VWR，目录号：720-1984）

软件

显微镜控制软件（Zeiss ZEN）
FLIM采集软件（Becker& Hickl SPCM）
FLIM配件软件（Becker& Hickl SPCImage）
图像分析软件（NIH ImageJ）

程序

常规培养MDA-MB-231细胞
1. 培养物控制（杂交质粒）和单克隆抗体敲低MDA-MB-231细胞，在补充有10％FBS，2mM GlutaMAX ，100U/ml青霉素的Advanced DMEM中， 100μg/ml链霉素。
2. 在37℃，5％CO 2培养箱中，在含有10-12ml生长培养基的75cm 2的组织培养瓶中保持细胞作为单层。
3. 通过在70-80％汇合时以1:10的比例分裂来保证每3-4天的通过。
4. 通过用2ml胰蛋白酶的初步洗涤分离细胞，然后与2ml新鲜胰蛋白酶孵育5分钟。
电镀细胞进行显微镜检查
1. 从75 cm 2烧瓶中弃去生长培养基，并用3 ml胰蛋白酶孵育5 min，分离细胞。
2. 通过加入5ml生长培养基收集细胞并抑制酶。
3. 将烧瓶的内容物转移到15ml Falcon管中，并在室温（24℃）下以400×g离心5分钟。
4. 将细胞重悬于5ml新鲜培养基中，并将少量（〜100μl）转移至Eppendorf管进行细胞计数。
5. 在台式显微镜上使用血细胞计数器和计数器计数再悬浮细胞浓度，确保将Eppendorf管的内容物与移液管充分混合以解决沉淀。
6. 使用细胞计数结果，将来自细胞悬浮液的1,800,000个细胞移液到新的50ml Falcon管中（每孔30孔细胞6孔板）。加满管，总共含有12ml（每孔2ml总培养基）。
7. 使用镊子，将一个盖玻片转移到6孔板的每个孔中。
8. 将2ml的180万个细胞混合物移入每个孔中，再次确保在转移之前使用移液管混合管的内容物。
9. 将6孔板置于培养箱中，放置过夜，以便在第二天成像之前将细胞附着到盖玻片上。
10. 在分离的6孔板中对每种细胞类型进行重复过程。
NAD氧化还原状态测定
1. 使用镊子将盖玻片从6孔板转移到金属成像环中（见图3）。拧紧直到感觉到少量阻力以确保防水密封。
2. 轻轻洗涤细胞（确保细胞未分离）将400μl成像缓冲液移至盖玻片上，以除去剩余的酚红。
3. 处理洗涤介质，轻轻移液400μl成像缓冲液至细胞上。
4. 将盖玻片转移到共聚焦显微镜的加热阶段，并在明场照明下使细胞聚焦。
5. 使用375nm长的二向色和435-485nm发射滤光片，逐渐增加351nm激发激光的强度，直到清楚地观察到NAD（P）H荧光。
6. 搜索盖玻片并放大图像，使得在视野中可以观察到10-20个细胞。
7. 开始时间序列采集，每2分钟成像一次。
8. 4张图像（从时间序列开始6分钟）后，轻轻地将100μl5μMFCCP溶液直接加入到细胞上，给出最终的FCCP浓度为1μM。由于增加的ETC活性，NAD（P）H荧光信号应开始降低。
9. 在FCCP处理（加入8分钟）后获得4张图像，轻轻地将100μl30μM鱼藤酮溶液直接加入到细胞上，得到最终的5％的鱼藤酮浓度。由于抑制ETC，NAD（P）H荧光信号应开始增加。
10. 在鱼藤酮加入10分钟后终止实验，总试验时间为24分钟。
11. 处理细胞并使用100％乙醇清洁可能与FCCP或鱼藤酮（例如成像环，显微镜物镜）接触的任何实验设备。
12. 重复所有盖玻片的程序，并保存数据供后续分析。
NAD（P）H FLIM测定
1. 在金属成像环中用400μl成像缓冲液（与氧化还原状态测定相同）准备盖玻片，并在显微镜上放置，调整焦点以在明场照射下观察细胞。
2. 使用650nm的短路二色性和435-485nm的发射滤光片，逐渐增加720nm激发激光的强度，直到用显微镜的内部检测器观察到NAD（P）H荧光。
3. 搜索盖玻片并放大图像，使得在视野中可以观察到10-20个细胞。
4. 调整显微镜设置，将荧光信号发送到FLIM探测器所在的非下行端口。
5. 开始FLIM数据采集，扫描2分钟。
6. 移动到盖玻片上的新位置并重复过程。每个盖玻片获取3-5张图像。
7. 处理细胞并使用100％乙醇清洁可能与FCCP或鱼藤酮（例如成像环，显微镜物镜）接触的任何实验设备。
8. 重复所有盖玻片和细胞类型的步骤。

数据分析

NAD氧化还原态测定（参见图4）

图4.线粒体NAD氧化还原状态测定的示意图。 使用1μMFCCP和1μM鱼藤酮处理后的荧光强度作为动态范围，通过该动态范围可以评估降低的NADH的静息荧光强度，从而降低NADH的静息百分比。阈值用于选择高于定义的亮度值（，即，包含单元格的像素）的像素，减少背景噪声的影响。

将时间序列图像导入ImageJ。数据集将被表示为"堆栈"，x轴和y轴表示图像的空间坐标，z轴表示自实验开始以来的时间。可以通过移动水平滚动条导航时间序列。
使用阈值工具以红色高亮显示单元格区域。应选择最小值和最大值，使得在任何时间点没有选择背景信号，并且不应该忽略明亮的细胞内区域（例如，鱼藤酮）。
通过在"设置测量"对话框中单击"限制到阈值"，确保测量被限制到阈值区域，否定背景荧光的影响。
通过从Stacks菜单中选择Plot Z轴曲线绘制NAD（P）H荧光信号的时间演变。将数据导出到Microsoft Excel。
对每个时间序列采集重复此过程。
在Excel中，通过应用以下公式，将每个时间点F（t）的浓度按其时间序列的最小值（含FCCP）和最大值（与鱼藤酮值）进行比较： br />
该过程的正确应用将使每个时间序列的最小值为0％，最大值为100％。
对于每个细胞系，采取在静息条件下获得的所有缩放数据点的平均值，以计算最终的NADH（％）值。将不确定性表示为这些要点的标准误差。每个细胞系的NADH（％）值之间的任何差异的统计学意义可以使用Wilcoxon有符号秩检验进行评估。

NAD（P）H FLIM测定（参见图5）

图5. FLIM分析软件。在SPCImage（A）中执行双指数荧光衰减到FLIM图像的拟合。参数矩阵输出到ImageJ（B）进行后续分析。通过组合通过阈值产生的整个细胞的掩模，并排除手动绘制的核区域，产生含有细胞溶质和线粒体的感兴趣区域。

在SPCImage中，导入FLIM图像并调整设置以在每个像素处适合2个衰减分量。
为了确保足够的准确性，应该增加合并，直到在感兴趣的最暗的胞质像素中的衰减峰值中包含超过100个计数（Blacker等人，2014）。对于激光功率保持足够低以避免电池损坏的2分钟采集，这通常需要2到4的合并因子，对应于来自24和80周围像素之间的数据的总和。
通过选择计算衰减矩阵开始每个像素的拟合过程。这个过程可能需要5分钟，这取决于所使用的计算机的功率。
导出每个衰减参数的矩阵 - <2> （％），， - 光子计数每个像素用于ImageJ中的后续分析。
导入α₂ （％），< img width ="10" height ="11" alt =""src="/attached/image/20170119/20170119000426_9254.jpg"/>，并且使用导入文本图像命令将光子计数图像转换为ImageJ。
在光子计数图像上使用阈值和创建选择命令，将包含单元格的感兴趣区域（ROI）添加到ROI管理器。
使用多边形选择工具创建单元格核的投资回报率并保存到投资回报率管理器。由于代谢与细胞其余部分的差异，核通常具有改变的NAD（P）H荧光衰减特性，因此为了简单起见，这里忽略了这些分析。
从单元格ROI创建一个蒙版。在掩码窗口中选择核ROI，并填充黑色。使用阈值来选择包含白色单元体和黑色核的结果图像。将此选择添加到ROI管理器。
使用细胞体ROI测量平均值，，和强度 I> 。
对每个图像重复该过程，将每个参数的结果传输到Excel。对于每个单元格类型，计算每个参数的平均值（±SE）值。使用Wilcoxon有符号秩检验可以评估参数值的差异，以获得统计学显着性。
在每个细胞系中，NADPH与NADH的比例可以与使用
的测量参数相关
测量的强度和剩余的衰变参数可用于计算酶结合的NADH和NADPH的相对浓度，使用，

哪里，
假设实验设置（例如，激光功率）保持恒定，所有实验之间共享任意常数。

笔记

电镀细胞进行显微镜检查

盖板可以在放入6孔板之前进行灭菌。这可以通过高压灭菌，通过火焰或浸入乙醇来实现。留下足够的时间让盖玻片冷却，或者在将细胞悬浮液加入到孔中之前，所有痕量的乙醇蒸发。
不同的细胞系对玻璃表现出不同的粘附性。附着不良的细胞可能需要用明胶，纤连蛋白或聚-L-赖氨酸处理盖玻片。盖片也可以预先处理。

NAD氧化还原状态测定

相对于使用共焦显微镜常规成像的外在荧光团，NAD（P）H荧光强度较低。因此，应注意在实验记录之前对信号进行全面优化。在实验的〜30分钟时间内，所选择的采样激光功率不应该高到引起漂白和相关的光损伤（Tiede和Nichols，2006）的检测信号。应选择可用的最高数值孔径物镜，这可能需要使用倒置配置的油浸透镜。应该调整激光准直器以最大化对比度，并且共聚焦针孔应尽可能大，因为该测定中不需要精确的z分辨率。最后，在初步实验中应选择检测器增益和偏移设置，使得FCCP不会使检测到的信号达到零，并且鱼藤酮不会导致检测器饱和。
必须保持采集设置（例如，，激光功率和检测器增益），以便在技术和生物重复之间获得可比较的结果。由于测量的强度是使用单光子激发施加的激光功率的线性函数，所以如果激光功率被改变，则可以应用线性校正（归一化）。共焦显微镜上的增益对强度有非线性影响，如果调整，则使归一化不切实际。理想情况下，分析中的阈值设置也应在给定的一组实验中保持不变，特别是如果在不同条件或细胞系之间比较绝对水平的NAD（P）H。
为了帮助选择激发波长和过滤，NAD（P）H的吸收和发射光谱包括在图6中，改编自Patterson等人（2000）。

图6. NAD（P）H 的吸收和发射光谱（改编自Patterson等人，2000）
在添加FCCP或鱼藤酮后，NAD（P）H荧光信号应允许达到稳定水平，然后在实验条件随后改变之前（添加下一种药物或终止实验）。这可能需要比这里建议的8分钟更长的时间，因为药物在盘子周围混合所花费的时间。通过吸取更大体积的更稀释溶液以达到最终浓度，可以帮助该过程。
FCCP和鱼藤酮的主要作用是分别氧化和还原NAD池。因此，这可以被视为线粒体NAD氧化还原状态的测定。然而，这些治疗可能通过线粒体烟酰胺核苷酸转氢酶（NNT）的作用对NADP池具有继发作用。这将氧化NADH以在对照和鱼藤酮处理的条件下还原NADPH，但是可以逆转消耗NADPH并用FCCP补充NADH供应（Nickel等人，2015）。由于NAD池比NADP池大得多，因此对最终结果的定性影响将是最小的，但是当试图得出定量结论时应注意这一点（Blacker和Duchen，2016）。
一旦实验方案已被正确建立，该测定通常是高度可重复的，通过相同实验的标度荧光水平的典型标准偏差约为2％。这允许约3-5次重复足以对最终结果具有统计信心。

NAD（P）H FLIM测定

由于FLIM所需的检测器具有单光子灵敏度，因此它们对亮光源的保护至关重要。快门组件应与检测器一起购买，显微镜本身上的遮光窗帘（图1）应用于保护室内灯光，并且应在实验中使用汞灯。检查器和显微镜之间的密封应经常检查，以确保没有光线可能泄漏。
为了从FLIM数据中最精确地提取荧光衰减参数，应向SPCImage提供系统仪器响应功能的测量值。这可以通过测量散射物体的荧光寿命分布来获得。例如，我们通常使用磷酸二氢钾（KDP）晶体的二次谐波生成信号，通过在盖玻片上留下摩尔溶液蒸发过夜而生长。
该协议已被写入，假设双光子激发将用于FLIM。脉冲紫外激光器存在，允许使用单光子激发的NAD（P）H荧光寿命测量。然而，脉冲Ti：蓝宝石激光在生物医学显微镜设备中是普遍存在的，以便在厚样品上进行双光子强度成像。因此，FLIM附加组件通常安装在这些现有系统上。
根据NADH和NADPH的不同浓度（方程2-4），用于解释NAD（P）H FLIM数据的模型受许多假设的约束（Blacker等人，2014）。假设酶结合人群中两个辅因子的平衡反映了在自由人群中，这些物种被假设为具有有限的，不同的生命周期。这些模型已经显示出在许多生物环境中解开NADH和NADPH的独立作用的成功（Blacker等人，2014; Nickel等人，2015; Tosatto 等，，2016）。然而，通过对增强对酶结合辅因子的对比光物理学的理解以及它们与潜在代谢的关系的进一步改进，它们的定量精确度将会增加。
由于TCSPC技术固有的噪声，在NAD（P）H FLIM图像中测量的荧光寿命中存在像素到像素的变异性。从感兴趣的区域提取平均生命周期价值已显示否定了这种泊松噪声的影响，报告了真正的潜在寿命价值（Blacker等人，2014）。荧光衰减参数中的细胞与细胞变异性也存在，标准偏差约为5％。因此，我们通常在3-6个盖玻片上获得每个盖玻片3-5个图像，以评估条件之间的荧光衰减参数的统计学显着差异。

食谱

常规细胞培养液（500 ml）
440毫升高级DMEM（500毫升瓶，60毫升去除）
50ml胎牛血清（10％终浓度）
5ml GlutaMAX （2mM终浓度）
5毫升青霉素 - 链霉素（100毫升青霉素和100mg毫升-1链霉素最终）
活细胞成像培养基（50ml）
415mg DMEM粉末 0.5ml GlutaMAX （2mM终浓度）
225 mg D - （+）葡萄糖（25 mM终浓度）
5.5毫克丙酮酸钠（1毫摩尔终浓度）
119 mg HEPES（10 mM终浓度）
用超纯水
加满50毫升调节pH至7.4，使用NaOH增加或使用HCl减少
使用注射器过滤器进行杀菌
ETC扰动

FCCP：将2.5mg在10ml乙醇中的1mM储备溶液（储存在冷冻器中）。在实验一天，在5ml成像培养基中稀释25μl5μM工作溶液
鱼藤酮：在10ml乙醇中用于1mM储备液（储存在冷冻箱中）3.9mg。在实验一天，在5ml成像介质中稀释150μl30μM工作溶液

致谢

使用NAD（P）H自发荧光来评估活组织的氧化还原状态是由Britton Chance于1950年代发起的（Chance等人，1962; Chance等人。 >，1952; Chance和Williams，1955）。这些协议将这一开创性工作扩展到现代化设备上。我们承认BBSRC授权BB/L020874/1的支持。

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