材料和试剂

Corex ^®离心管（30ml）（Corning，USA）
注意：本产品已停产。可替换物品：来自Krackeler Scientific的30ml玻璃管，目录号：6-45500-30。
Miracloth（孔径：22-25μm）（EMD Millipore，目录号：475855）
移液头（10μl，200μl，1 ml）和"切断"移液管吸头（1 ml），用剪刀切割顶部（〜2 mm）
Falcon管（50ml）（Greiner Bio One，目录号：227261）
2 ml管
铝箔
闪烁瓶（SARSTEDT，目录号：58.536）和推盖（SARSTEDT，目录号：65.816）
大约4周龄的拟南芥植物（见注释）
Percoll（GE Healthcare，目录号：17-0891-01）
2
80％（v/v）丙酮（Carl Roth，目录号：9372.2）
Ca储备溶液（1mCi [37MBq]，CaCl 2> 10Ci/g）（PerkinElmer，目录号NEZ013001MC）
（0.5N HCl> 20Ci/g）中的Mn储备溶液（200μCi[7.4MBq]，MnCl 2）（PerkinElmer，目录号：NEZ040200UC）
氯化钙（CaCl 2）（Carl Roth，目录号：A119.1）
锰（II） - 硫酸一水合物（MnSO 4·H 2 O）（Carl Roth，目录号：4487.1）
0.1％（w/v）SDS（Carl Roth，目录号：CN30.4）
Rotiszint ^® Eco Plus闪烁鸡尾酒（Carl Roth，目录号：0016.3）
山梨醇（Carl Roth，目录号：6213.2）
Tricine（Carl Roth，目录号：6977.5）
硝酸钠（NaOH）（Carl Roth，目录号：P031.2）
EDTA（Carl Roth，目录号：8040.2）
氯化镁（MgCl 2）（Carl Roth，目录号：KK36.1）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
BSA（Carl Roth，目录号：8076.3）
氯化锰（II）脱水（MnCl 2）（EMD Millipore，目录号：105934）
EGTA（Carl Roth，目录号：3054.2）
HEPES
⁴⁵ Ca工作溶液（见配方）
⁵⁴锰工作溶液（见配方）
5倍重悬浮缓冲液，pH 8.4（参见食谱）
均质缓冲液，pH 8.4（参见食谱）
导入缓冲液，pH 8.0（参见食谱）
洗涤缓冲液，pH 8.0（参见食谱）
裂解缓冲液，pH 7.6（参见食谱）

设备

冷室配有绿灯（500-530nm）
自动移液器控制器（BrandTech Scientific，型号：Accu-Jet ^{®）/10毫升玻璃移液器}
Waring搅拌机（Waring Laboratory Science，型号：7011S），带钢容器和四个剃刀刀片
具有转子JA-14和JS-13.1（Beckman Coulter，型号：AvantiTM J-25）的Beckman-Avanti ^TM J-25离心机
注意：本产品已停产。可更换物品：Beckman Avanti J-E系列离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-E）。
离心机类型4K15C用于Falcon管（Sigma Laborzentrifugen，型号：4K15C）或任何其他适用于Falcon管的离心机
用石英比色皿的UV/Vis分光光度计（Biochrom，型号：Ultrospec ^{TM 2100）}
光源Faser-Illuminator（Heinz Walz，型号：FL-460）设置为90μmol光子m ^{-2 ^{sec ^-1}}
涡旋振荡器（科学绝缘体，型号：Genie2）
离心机5418 R，转子FA 45-18-11用于2 ml管（Eppendorf，型号：5418 R）
液体闪烁计数器（PerkinElmer，型号：Tri-Carb< 2910TR）
同位素实验室，允许⁵⁴锰处理，铅皮和铅屏蔽（约5厘米）

程序

制备Percoll梯度
1. 将所有材料，试剂和缓冲液放在冷藏室中，以在4°C温度平衡。
2. 通过混合4毫升Percoll，2毫升5x重悬浮缓冲液，pH8.4和4毫升H 2 O 2上清液来制备10ml Percoll溶液（40％）。
3. 通过混合8ml Percoll和2ml 5x重悬浮缓冲液（pH 8.4）来制备10ml Percoll溶液（80％）。
4. 填充到Corex管中，加入9ml 40％Percoll溶液，并使用10ml玻璃移液管和自动移液管控制器小心地将9ml 80％Percoll溶液底层保存在冰上直至进一步使用（图1）。 >
  
  图1. Percoll梯度的制备和完整叶绿体的分离（方法A和B）
完整叶绿体的分离
1. 收获12克新鲜的叶子材料过夜暗适应拟南芥植物（见注释）。在配备绿灯（500-530 nm）的寒冷室内执行所有步骤。
2. 向叶片材料中加入180ml均质缓冲液（pH8.4），并在Warring混合机中以18,000rpm（对应于按钮'Hi'）均质化4×3秒。
3. 将匀浆通过两层Miracloth过滤，并在4℃下在JA-14转子中以1,500×g离心5分钟。
4. 删除上清液，并将小丸重新悬浮在1ml 1x重悬浮缓冲液pH 8.4中，仔细倒置管
5. 通过在Percoll梯度顶部仔细地使用切断移液管尖端转移重悬的颗粒（=叶绿体悬浮液）（图1）。
6. 密度梯度离心在JS-13.1转子中在4℃和7,000×g/g下进行15分钟，使用缓慢的加速度并且减速。离心后，叶绿体位于顶部馏分中，完整的叶绿体位于两个Percoll层的界面（图1）。>
7. >去除破碎的叶绿体和上层溶液，并使用切断的移液管小瓶将完整的叶绿体转移到Falcon管中。
8. 用25ml 1x重悬浮缓冲液pH8.4洗涤完整的叶绿体。该步骤去除残留的Percoll。在4℃下以1,500×g离心5分钟。
9. 在500μl进口缓冲液pH 8.0（Ettinger等人，1999）中重悬沉淀（=完整叶绿体），转移到2ml管中，包裹在铝箔中并保持在冰上。
叶绿素浓度的测定
1. 用990μl80％丙酮稀释10μl完整的叶绿体溶液，并在冰上和黑暗中孵育10分钟。
2. 离心机16,000 xg（离心机5418 R）在室温下离心2分钟，并立即将上清液转移到石英比色皿中，以在750 nm（用于基线校正）测量，在紫外/可见光下为663 nm和646 nm，可见分光光度计。使用80％丙酮作为空白样品。
3. 用下列公式计算叶绿素含量（Porra，2002）：
  663 = 12.25×A 663 - 2.55 x A 646
  l>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> （Chl _a + Chl _b）x 100 = xxxμgChl/ml
  用进口缓冲液pH 8.0将叶绿素浓度调整到0.3mg/ml，并将样品分成45μl等分试样（=完整的叶绿体），包裹在铝箔中并保持在冰上。整个过程每个同位素实验需要15等份。
制备⁴⁵ Ca或⁵⁴ Mn工作溶液
1. 执行同位素实验室的所有步骤。对于处理⁵⁴ Mn，必须戴铅笔，并用铅墙（5厘米）屏蔽放射性样品。在接下来的几天分别进行⁴⁵ Ca测定和⁵⁴锰测定，例如，使用新鲜制备的叶绿体。
2. 取4μl⁴⁵ Ca储备溶液，并用76μlCaCl 2（15μM）稀释（1:20）。混合均匀，该混合物相当于⁴⁵ Ca工作溶液，适用于15（+1）反应。
3. 取4μl⁵⁴ Mn储备溶液，并用76μlMnSO 4（1.5μM）稀释（1:20）。混合均匀，该混合物对应于⁵⁴ Mn工作溶液，适用于15（+1）反应。
将⁴⁵ Ca或54Mn摄入叶绿体（图2）

图2.实验装置的模式将完整的叶绿体与^{45 Ca（A和B）或^{54 Mn（C和D））在90μmol光子中进行20分钟，其中m ^{sec ^-1。光孵化后，将样品在山梨醇中孵育，不涡旋以保持叶绿体完整（A和C），或样品不用山梨醇孵育，但涡旋释放类囊体（B和D）。使用EGTA作为螯合剂来复合二价阳离子，附着在膜的外面
为了开始进口反应，将45μl等分试样（=完整的叶绿体，步骤C3）与5μl的< sup>> Ca工作溶液（步骤D2）或/溶液（步骤D3），去除铝箔，并立即将样品暴露20分钟至90μmol光子，其中m ^{-2 ^-1。
用三个重复的三个等分试样设置反应。}
向每个等分试样中加入1ml进口缓冲液，pH 8.0，并在黑暗中孵育10分钟（总孵育时间为30分钟）。进口缓冲液含有山梨醇，因此在该孵育步骤中叶绿体保持完整
在4℃下离心16,000 x g（离心机5418R）1分钟，除去上清液。将沉淀重悬于1ml洗涤缓冲液（pH8.0）中并涡旋2秒。由于洗涤缓冲液含有EGTA作为螯合剂，所以该步骤除去在膜表面结合的⁴⁵ Ca或⁵⁴
在4℃下离心16,000 x g（离心机5418R）1分钟，除去上清液。将沉淀重悬于50μl0.1％SDS中，并立即转移至4 ml闪烁液中。混合均匀并将样品保持在室温直到计数。}}}
将⁴⁵ Ca或^{54摄入到叶绿体中，随后释放类囊体（图2）为了开始进口反应，将45μl等分试样（=完整的叶绿体，步骤C3）与5μl的< sup>> Ca工作溶液（步骤D2）或/溶液（步骤D3），去除铝箔，并立即将样品暴露20分钟至90μmol光子，其中m ^{-2 ^-1。
用三个重复的三个等分试样设置反应。}
向每个等分试样中加入1ml进口缓冲液，pH 8.0，并在黑暗中孵育10分钟（总孵育时间为30分钟）。进口缓冲液含有山梨醇，因此在该孵育步骤中叶绿体保持完整
在4℃下离心16,000 x g（离心机5418R）1分钟，除去上清液。将沉淀重悬于1ml洗涤缓冲液（pH8.0）中并涡旋2秒。由于洗涤缓冲液含有EGTA作为螯合剂，所以该步骤除去在膜表面结合的⁴⁵ Ca或⁵⁴
在4℃下离心16,000 x g（离心机5418R）1分钟，除去上清液。将沉淀重悬于50μl0.1％SDS中，并立即转移至4 ml闪烁液中。混合均匀并将样品保持在室温直到计数。}
在冰上10分钟温育步骤中估计摄取超氧化物或半胱氨酸的附加反应
为了开始进口反应，将45μl等分试样（=完整的叶绿体，步骤C3）与5μl的< sup>> Ca工作溶液（步骤D2）或/溶液（步骤D3），去除铝箔，立即进行步骤E2至E4和F2至F4。因此，总孵化时间为黑暗中冰上10分钟。设置三个等分试样的反应，每个等分试样对应三次重复
估计背景辐射的附加反应
为了估计背景辐射，将45μl等分试样（=完整叶绿体，步骤C3）与5μl的< sup>> Ca工作溶液（步骤D2）或与⁵⁴ Mn工作溶液（步骤D3），移除铝箔，立即进行步骤E3〜E4。设置三个等分试样的反应，每个等分试样对应三次重复
确定放射性的结合
收集闪烁瓶形成步骤E4，F4，G和H，并确定液体闪烁计数器Tri-Carb 2910 TR中的每分钟计数（cpm）。使用程序＃5确定⁴⁵ Ca值，并使用程序＃8以每个闪烁瓶5分钟计数时间确定⁵⁴ Mn值。

数据分析

从步骤I收集cpm值，并将值插入到Excel工作表中。
从所有其他cpm值（步骤E4，F4和G）减去平均背景辐射（步骤H）的cpm值。虽然在10分钟冰温度（步骤G）后得到的值不用于后续计算，但应明显低于30分钟孵育后获得的值。如果不是这样，结果不能解释为"轻度依赖性摄取"。
将cpm值转换为相对单位，例如，从步骤E4获取30分钟孵育时间后的平均cpm值，并将其设置为"1"的相对单位。可以容易地比较用独立的植物和同位素进行的实验。
类囊体到叶绿体中的基质分布可以从在类囊体组分（步骤F4）和完整的叶绿体组分中单独检测到的放射活性量估计（步骤E4）。将从完整的叶绿体级分（步骤E4）获得的cpm值设置为100％，并计算类囊细胞级分的cpm值的百分比（步骤F4）。
描述了三个技术重复的整个过程（步骤A至I）（参见步骤F1）。应该用独立生长的植物进行两到三次（=独立实验）。

笔记

拟南芥生长可以如Steinberger等人，2015所述进行。该方案也适用于两周龄的豌豆植物。为了分离完整的叶绿体，重要的是避免在光照期间积聚的任何淀粉颗粒。叶绿体内的淀粉颗粒可能会阻止完整叶绿体在两个Percoll层的界面积聚。因此，黑暗适应植物至少16小时;夜间淀粉降解发生。

食谱

⁴⁵ Ca工作溶液（使用新鲜制剂）
4μl⁴⁵ Ca储液溶液
76μlCaCl 2（15μM）
⁵⁴ Mn工作溶液（使用新鲜制剂）
4μl⁵⁴锰储备溶液
76微升MnSO 4（1.5微米）
5倍重悬浮缓冲液，pH 8.4（可在4℃下储存几天）
0.4 M山梨醇
20mM Tricine/NaOH，pH8.4
2.5 mM EDTA
5mM MgCl 2
均质缓冲液，pH 8.4（可在4℃下储存几天）
0.4 M山梨醇
20mM Tricine/NaOH，pH8.4
10 mM EDTA
5mM NaHCO 3
0.1％（w/v）BSA
1mM MgCl 2
1mM MnCl 2
进口缓冲液，pH 8.0（可在4℃下储存几天）
0.33 M山梨醇
50 mM Tricine/NaOH，pH 8.0
5mM MgCl 2
洗涤缓冲液，pH 8.0（可在4℃下储存几天）
0.33 M山梨醇
50 mM Tricine/NaOH，pH 8.0
50 mM EGTA
裂解缓冲液，pH 7.6（可在4℃下保存数周）
10mM HEPES/NaOH，pH7.6。
5mM MgCl 2

致谢

我们非常感谢Gabi Burkhard提供卓越的技术援助。这项工作是在德里·莱斯特（Prof.Dario Leister）的实验室（德国慕尼黑的生物制品公司生物技术研究所）进行的，并得到了德国富士施隆公司的资助。该协议由施耐德等人于2016年改编。

参考文献

Ettinger，WF，Clear AM，Fanning，KJ和Peck，ML（1999）。鉴定植物叶绿体类囊体膜中的Ca ^{2 +}/H ⁺ antiport 植物生理 119：1379-1386。
Porra，RJ（2002）。开发和使用联立方程，以准确测定叶绿素a和/b> 和 b 。 149-156。
Schneider，A.，Steinberger，I.，Herdean，A.，Gandini，C.，Eisenhut，M.，Kurz，S.，Morper，A.，Hoecker，N.，Ruhle，T.，Labs， Flugge，UI，Geimer，S.，Schmidt，SB，Husted，S.，Weber，AP，Spetea，C.和Leister，D。（2016）。进化上保守的蛋白质光合作用影响突变体71是拟南芥中类囊体膜上有效锰摄取所必需的。植物细胞 28（4）：892-910。
Steinberger，I.，Egidi，F.和Schneider，A.（2015）。