第一部分：通过病毒转染诱导多巴胺神经元中的channelrhodopsin表达 >

材料和试剂

玻璃PCR微量移液管，1μl标记（Drummond Scientific，目录号：5-000-1001-X10）
Kimwipe
注射器
Q-tip
手术刀片No.11（Thomas Scientific，目录号：3883B59）
针
小鼠（The JACKSON LABORATORY，Strain 006660：DAT ^IREScre）
注意：该敲入小鼠在内源性多巴胺转运蛋白（DAT）启动子的转录控制下表达cre重组酶。为了最小化对DAT启动子功能的干扰，cre重组酶表达通过内部核糖体进入序列（IRES）从3'非翻译区驱动。
使用AAV5-EF1α-DIO-hChR2（H134R）-EYFP（滴度：8×10e-12病毒体/ml）（Addgene，目录号：20298）来驱动ChR2-EYFP的依赖性表达。腺相关病毒（AAV）可以从北卡罗来纳大学的载体核心的Karl Deisseroth博士的MTA获得;该AAV是血清型5和复制无能。
石蜡
10％漂白溶液
Carprofen（Rimadyl，Zoetis）
盐酸氯胺酮（Ketved，Vedco）
赛拉嗪（Akorn，AnaSed ^®）
Puralube VET软膏，无菌眼部润滑剂（Dechra）
盐酸利多卡因（40 mg/ml）用于局部麻醉（Boehringer Ingelheim）
Vetbond，氰基丙烯酸正丁酯胶粘剂（3M）
70％乙醇溶液
Betadine
新孢子素
盐水

设备

移液器拉杆（Sutter Instruments，型号：P97）
Nalgene ^{TM聚氨酯管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：8030-0060）}}
Nalgene ^{TM 180透明塑料PVC管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：8000-0004）}}
定制阀控制器，提供24 V的瞬时脉冲，功率为5瓦（通用阀门公司获得的改进的脉冲控制器，型号：9-82-902）
注意：本产品已停产。作为替代方案，使用具有TAXIC900立体定位框架的UltraMicroPumP III（世界精密仪器，型号：UMP3），可以精确控制病毒的传播速率。
空气压力调节器（普通冷冻和特种气体公司）
吹风机（例如，，Wahl Clipper，型号：09916-4301）
加热垫，水循环
鼠标立体定位仪（Stoeling，目录号：51730D）
电磁阀（例如，Parker Hannifin，部件号：001-0028-900）
手术刀柄（Thomas Scientific，目录号：3883H10）
相机（例如，，显微镜，型号：5MP，目录号：AM7115MZT）
视频监视器（例如，，宏碁）
钻（Black& Decker，型号：RTX）

程序

手术准备（时间30-45分钟）
1. 使用Sutter吸管拔出器拉出Drummond玻璃移液器，然后通过抚摸Kimwipe上的尖端将尖端回到20-40μm之间的尖端直径（见图1）。
2. 使用聚氨酯管将电磁脉冲发生器连接到气压调节器;连接带有聚乙烯管道的壁挂式球阀（图2）
3. 用病毒溶液回填玻璃移液管（每只鼠2μl）。将移液管尖固定到立体定位支架臂上，然后使用PVC管将移液管连接到连接到三通旋塞阀上的注射器。将一滴病毒溶液（每只小鼠至少2μl）放在用石蜡包裹的干净的表面上，以免打破移液器吸头。移动立体定位支架臂以将移液器尖端接触病毒液滴，然后拉动注射器以缓慢施加负压，并用病毒溶液填充移液管。将吸管与病毒溶液保持在一个封闭的盒子里面，湿纸巾在底部保持湿度，直到你准备好注射。任何与病毒接触的表面均应用10％漂白溶液清洗。
  
  图1.用于颅内注射病毒溶液的玻璃移液管的图像。左侧，用于AAV注射的移液管图像（每1μl分级;最大10μl）。右，移液管尖端的显微照片（直径33μm）。
  
  图2.使用电磁阀提供时间控制脉冲的压缩空气用于通过玻璃移液器管理病毒的设置示意图
手术和病毒注射（时间20-30分钟）

管理皮下注射在卡洛芬颈部（5 mg/kg）术前用于抢先镇痛及其抗炎作用。

用含有氯胺酮（100mg/kg）和赛拉嗪（10mg/kg）的溶液麻醉小鼠。如果小鼠体重小于20g，则服用一半剂量。以10ml/kg的体积通过腹膜内（i.p.）注射给药。

用剪发器刮头皮。

将Puralube VET软膏用于眼睛。

将鼠标放在加热垫（37°C）上，将鼻子固定在嘴巴和鼻夹中，并使用耳塞稳定头部。

清洁头骨上方的皮肤，先用betadine然后用酒精。

使用Q-tip使用利多卡因溶液。

使用手术刀刀片，做一个切口，将覆盖颅骨的皮肤推到侧面。

将一块金属管连接到立体定位探头支架上，并使用坐标指向腹侧被盖区域（VTA）标记颅骨。对于体重超过25g的小鼠，使用以下坐标：前后（AP） - 3.4mm和相对于胎膜的外侧（L） -/+ 0.5mm，以及距硬脑膜的背部（DV） - 4.5mm。将体重为12至16g的小鼠的坐标调整为AP-3.0mm和DV-4.1mm，对于体重为17至24g的小鼠，将坐标调整为AP-3.3mm和DV-4.3mm。不要使用玻璃移液管标记颅骨上的坐标，因为尖端可以轻易破裂。

在两侧钻孔，用盐水清洁暴露的头骨。

将带有病毒溶液的玻璃移液管置于立体定位设备的探头支架中，并使用PVC管将移液器连接到电磁阀（参见图1中的原理图）。在将移液器放入大脑之前，请确保压缩空气的定时电磁控制脉冲有效地喷射病毒溶液。如果病毒解决方案没有出来，使用饱和盐水的Kimwipe轻轻清洁移液器吸头。

在放下移液管之前，用针头轻轻地刺穿硬膜。

缓慢（每秒约0.2 mm）将移液管降低至目标深度+ 0.1 mm。然后将移液管提升0.1 mm至目标深度（4.3 mm）。这为病毒解决方案创造了一个口袋，并在传送病毒解决方案时减少了所需的压力。使用定时电磁阀控制的压缩空气脉冲每侧注入1μl病毒溶液。

注射后放置移液器3分钟，以减少注射轨道的回流，然后将其取出。

两次注射后，用盐水清洗头骨，用镊子将皮肤推入皮肤，并用Vetbond将头皮切口封闭，使其固化（1分钟），然后应用新孢菌素软膏。然后，从立体定位装置中取出动物。

每天处理Carprofen 3天以减轻疼痛。

第二部分：使用免疫荧光测定ChR2表达在多巴胺神经元中的功效和选择性 >

病毒转染可提供多拷贝的ChR2并诱导强烈的表达。然而，ChR2表达因动物而异，因此在确定功能性连接物时需要确定转基因的特异性和功效。用于EYFP标签的脑部分的免疫染色的可视化使得能够追踪多巴胺能投射，评估其多巴胺能状态并通过指导记录为系统记录提供了综合的基础。

材料和试剂

多孔板（Thomas Scientific，目录号：1219C16）

培养皿（Thomas Scientific，目录号：1182N84）

Coverslips（例如，，Corning，目录号：2980-245）

显微镜载玻片（例如，Thomas Scientific，目录号：1178T40）

盐酸氯胺酮（Ketved，Vedco）

赛拉嗪（Akorn，AnaSed ^®）

肝素（Swiss Vault Engine，目录号：25021-400-66）

磷酸盐缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：P3619）

Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D5652）

甘氨酸（分子量：75.07）（Sigma-Aldrich，目录号：410225）

正常驴血清（EMD Millipore，目录号：S30-100mL）

Triton（Sigma-Aldrich，目录号：X100）

识别增强黄色荧光蛋白（EYFP）的绿色荧光蛋白（GFP）（EMD Millipore，目录号：AB3080）的兔多克隆抗体

识别多巴胺神经元特异性标志物的酪氨酸羟化酶（TH）（EMD Millipore，目录号：MAB318）的小鼠单克隆抗体

驴抗兔Alexa Fluor ^{488二抗（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-21206）}

驴抗小鼠Alexa Fluor 594二抗（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-21203）

ProLong Gold安装介质（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：P36930）

多聚甲醛（PFA，16％）（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）

甘油（分子量：92.09）（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）

乙二醇（分子量：62.07）（Sigma-Aldrich，目录号：324558）

Tris HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T2413）

设备

刷（小油漆刷）

振动切片机（Leica Biosystems Nussloch，型号：VT1200S）

实验室振动筛（Benchmark Scientific，型号：BlotBoy）

幻灯片存储盒（Thomas Scientific，目录号：1202N78）

共焦扫描显微镜（Olympus，型号：Fluoview FV1000）

软件

ImageJ（ imagej.nih.gov/ij/download.html）（Abràmoff等人，2004）

程序

脑固定切片（1天）

注射3-5周后，用i.p.注射氯胺酮（100mg/kg） - 地拉嗪（15mg/kg）溶液

使用含有10,000IU肝素/L的1ml温磷酸盐缓冲液（30℃，0.1M，pH7.4），然后用5ml的磷酸盐缓冲液，然后用5ml的4％PFA在磷酸盐缓冲液中快速灌注。 br />

将大脑和后缀在4％PFA溶液中去掉一夜。

将多孔板的每个孔用1ml冷冻保护剂溶液填充

在50微米的振动切片机上切片大脑，以产生冠状切片

将部分收集到多孔板中。

将脑切片置于-20°C直至加工。

免疫荧光染色和成像（3天）

用PBS在多孔板中洗涤振荡器（12rpm）5分钟;重复两次。

将部分移动到具有甘氨酸（100mM; 1ml /孔）的新的多孔板中以淬灭醛，并将多孔板放在振荡器上30分钟。

在PBS中洗涤切片5分钟;重复两次。

将具有正常驴血清（10％）的块在具有0.1％Triton的PBS中在摇床中稀释2小时。每孔加入1ml这种封闭溶液。

在含有2％正常驴血清和0.02％Triton的PBS中稀释抗体，抗GFP（稀释度：1:2000）和抗TH（稀释度：1:5000）。

将切片移动到含有抗-GG和抗TH抗体（1ml /孔）的新的多孔板中，并将切片在4℃振荡器上孵育过夜（至少16小时;为了更好的结果，离开抗体孵化在周末）

在PBS中洗涤切片5分钟。重复两次。

在室温下，在振荡器上用抗兔和抗小鼠二次抗体（稀释度：1:200，PBS-T 0.02％）孵育2小时。

洗涤PBS中的切片5分钟;重复两次。

在磷酸盐缓冲液中载玻片上的片段，让它们干燥5分钟

当完全干燥时，将几滴安装介质放在部分和盖玻片上，小心不要产生气泡。

在黑暗中离开幻灯片，室温过夜。

在盖玻片的边缘周围涂抹指甲油;这是为了防止盖玻片移动，因为安装介质不会干燥。

在4°C的幻灯片存储箱中存放幻灯片。荧光信号通常持续2年。

使用共聚焦扫描显微镜对感兴趣的区域进行成像，在这种情况下，腹侧被盖区域和黑质符合密度（参见Mingote等人，2015年的图1）。使用鼠标图集来确保对所有受试者进行相同的区域成像。

采用共聚焦显微照片堆叠（60倍油物镜;光学变焦1.4倍和 - 步长增量0.42微米; 800×800像素像素大小为0.189微米的像帧）通过整个组织部分（40至60张图像）。

数据分析

使用ImageJ线性调整共焦堆叠的对比度和亮度。

制作共焦堆叠的z投影图像（该图像将被用于计数），但是保持所有共焦图像堆叠的图像也会打开（此图像将用于识别不同类型的单元格）。

识别由几个共聚焦堆组成的每个图像中TH阳性（+）/ChR2-EYFP（ - ），TH（ - ）/ChR2-EYFP（+）和TH（+）/ChR2-EYFP（+）细胞的数量向上和向下滚动z轴并比较红色和绿色通道中的图像。

使用ImageJ单元格计数器插件计算z投影图像中每种类型单元格的数量。

计算每个立体定位的功效和特异性百分比值。病毒转染的效力计算为TH（+）和ChR2-EYFP（+）相对于TH（+）细胞总数的数量。病毒转染的特异性计算为与ChR2（+）细胞总数相关的TH（+）和ChR2-EYFP（+）的数量（参见下面的图3，或者在Mingote等人的图2） al 。，2015）。

使用非参数弗里德曼测试分析沿前后侧和内侧 - 横轴的差异，其显着性设置为0.05。

识别感兴趣的细胞的其他部分的投影区域，在这种情况下是确定从...记录的区域的腹侧中脑多巴胺神经元。

图3.确定ChR2表达在多巴胺神经元中的功效和特异性。来自侧面VTA和SNc的顶部面板，共焦z投影显微照片显示在洋红色中表达酪氨酸羟化酶（TH）的细胞，ChR2-绿色的EYFP和表达白色标记的细胞。在左侧的面板中，白色星星表示TH（+）和ChR2-EYFP（+）;蓝色星星表示TH（+）和ChR2（ - ）细胞。左下方，腹侧中脑示意图显示相对于AAV注射部位拍摄显微照片的位置。基于在顶部的显微照片中完成的细胞计数的右下，功效和特异性图。位于离注射部位更远的多巴胺神经元的功效降低。使用AAV-ChR2-EYFP的特异性非常高; TH（ - ）和ChR2-EYFP-细胞的数量可以忽略不计（在这里看不到）。

笔记

据报道，IgG存在于小胶质细胞中，这导致用抗小鼠二抗的假标记;然而，也已经显示这种标记是小鼠应变特异性的，并且取决于所使用的免疫染色程序（Hazama等人，2005）。我们的免疫染色方案没有产生小胶质细胞的任何非特异性染色。或者，可以使用在鸡或兔中制备的抗TH抗体。

使用Ai32小鼠（B6; 129S-Gt（ROSA）26Sortm32（CAG-COP4 * H134R/EYFP）Hze/J; RRID：IMSR_JAX：012569）（Madisen等人），可以转基因表达ChR2， em>，，2012）。转基因策略从病毒注射得不到，从动物到动物产生可靠的表达（图4）。为了直接比较这两种靶向多巴胺神经元的方法，另见Tritsch等人。（2012，补充图1）。然而，转基因策略中的ChR2特异性可能由于异位表达而受损。例如，使用血清素转运蛋白来驱动表达和ChR2转基因（，即SERT-cre :: Ai32小鼠）不是一个很好的策略来定位Raphe细胞核5-羟色胺神经元选择性地因为SERT启动子在发育期间在丘脑细胞中暂时活跃（Narboux-Nême等人，2008），并且这些细胞将在成年期继续表达ChR2。

图4. ChR2-EYFP在DAT IREScre 小鼠腹侧中脑TH（+）神经元中的表达，通过双侧注射AAV-ChR2-EYFP（上）或使用Ai32小鼠（底部）进行育种。使用这两种策略，ChR2表达特异于TH（+）细胞。然而，病毒策略可能无法针对所有TH（+），如顶部面板显微照片的左侧所示。当使用病毒策略时，ChR2表达功效高度依赖于注射成功和每只注射的小鼠感兴趣的脑区域内病毒的传播。因此，转基因策略的表达效率和可靠性要高得多（下图）。刻度尺表示400μm。

食谱

4％多聚甲醛（PFA）溶液（20ml） 10ml 0.2M磷酸盐缓冲液
5ml ddH 2 O
冷冻保护剂溶液（100ml）
30毫升甘油
30 ml乙二醇
60 ml 0.1 M Tris HCl

第三部分：使用切片电生理学和光遗传学确定多巴胺神经元的兴奋性功能性连接体 >

材料和试剂

Nalgene 4毫米注射器过滤器，0.2微米孔径，乙酸纤维素膜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：171-0020）}
1毫升结核菌素滑点注射器，1毫升（BD，目录号：309659）
用于填充微量移液器的非金属注射器针头，28 G，67 mm（世界精密仪器，目录号：MF28G67-5）
移液器提示
玻璃移液管
盐酸氯胺酮（Ketved，Vedco）
赛拉嗪（Akorn，AnaSed ^®）
氯化钠（NaCl）（分子量：58.44）（Sigma-Aldrich，目录号：746398）
氯化钾（KCl）（分子量：74.55）（Sigma-Aldrich，目录号：746436）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（分子量：84.01）（Sigma-Aldrich，目录号：S6014）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（分子量：119.98）（Sigma-Aldrich，目录号：S3139）
氯化钙脱水（CaCl 2）（分子量：147.01）（Sigma-Aldrich，目录号：223506）
氯化镁（MgCl 2）（分子量：95.21）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
葡萄糖（分子量：180.16）（Sigma-Aldrich，目录号：G6152）
Carbogen（95％O 2 + 5％CO 2）
SR95531（加巴嗪，GABAA拮抗剂）（分子量：368.23）（Abcam，目录号：Asc-042）
CGP55845（GABA 拮抗剂）（分子量：438.71）（Tocris Bioscience，目录号：1248）
SCH23390（D1拮抗剂）（分子量：324.24）（Tocris Bioscience，目录号：0925）
（ - ） - 舒必利（D2拮抗剂）（分子量：341.42）（Tocris Bioscience，目录号：0895）
东莨菪碱氢溴酸盐（毒蕈碱拮抗剂）（分子量：384.27）（Tocris Bioscience，目录号：1414）
利多卡因N，N-溴代（QX-314，细胞内钠通道阻断剂）（分子量：343.30）（Sigma-Aldrich，目录号：L5783）
6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮二钠盐（CNQX）（分子量：276.12）（Tocris Bioscience，目录号：1045）
葡萄糖酸（分子量：196.16）（Sigma-Aldrich，目录号：G1951）
氢氧化铯水合物（CsOH·H 2 O）（分子量：149.91）（Sigma-Aldrich，目录号：C8518）
HEPES（分子量：238.30）（Sigma-Aldrich，目录号：RDD002）
EGTA（分子量：380.35）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
ATP-Na 2（分子量：551.14）（Sigma-Aldrich，目录号：A2383）
GTP-Na 2（分子量：523.18）（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）
高糖aCSF（见配方）
标准aCSF（见配方）
细胞内溶液（见食谱）

设备

剪刀
振动切片机（Leica Biosystems Nussloch，型号：VT1200S）
注意：不同的振膜用于组织学和切片记录，以避免甲醛对切片健康的不利影响。
移液器拉杆（Sutter Instruments，型号：P97）
贴片移液器，标准硼硅玻璃毛细管（OD/ID 1.5/0.84 mm），带灯丝（World Precision Instruments，目录号：1B150F-4）
CCD相机（奥林巴斯，型号：OLY-150，停产），作为替代，具有实时成像模式的科学CMOS相机（例如，，Hamamatsu Photonics，型号：C11440-42U）可以使用
大功率蓝色LED（470nm; LED控制器电流设置为1A，对应于10V的LED电压）（Thorlabs，型号：DC4100）
荧光显微镜（Olympus，型号：BX61WI）具有60x浸水透镜
记录室（灌注室圆形）（Siskiyou，型号：PC-R）
参考电极（Ag-AgCl电极，1mm直径，3mm长）（World Precision Instruments，目录号：EP1）
微机械手（机械，赫ux黎式）（Siskiyou，型号：MX310R）
定制"竖琴"将切片固定到录音室（U形扁平铂 - 铱线与单个尼龙绳由氰基丙烯酸酯胶粘附）
浴液温度控制器（华纳仪器，型号：TC 344B）
贴片钳放大器（Molecular Devices，型号：Axopatch 200B）
计算机用于数据采集接口（HEKA Elektronik Dr. Schulze，型号：MICTECH ITC-18）或（Molecular Devices，型号：Axon DigiData 1500）

软件

Axograph X（Axograph Scientific）或pClamp 10（Molecular Devices）

程序

切片录制准备（1天）
1. 孵化脑切片时使用高葡萄糖人造脑脊髓液（aCSF）标准aCSF用于膜片钳记录。对于两者，准备10x的库存解决方案（参见食谱部分）。
2. 用QX-314细胞内溶液制备葡萄糖酸铯（参见食谱部分）和等分试样。
制作脑切片和膜片钳记录（1天）
1. 注射后3-5周，用氯胺酮（100mg/kg）+赛拉嗪（15mg/kg）麻醉小鼠。
2. 用剪刀沿着矢状缝线打开颅骨，反射颅骨瓣，并将脑部移入冰冷的高葡萄糖aCSF（75mM NaCl，2.5mM KCl，26mM NaHCO 3，1.25mM NaH 2 PO 4，0.7mM CaCl 2，2mM MgCl 2和100mM葡萄糖;参见食谱部分），饱和碳水化合物
3. 为每个感兴趣的区域制作300μm厚的切片。为了建立VTA多巴胺神经元的功能性连接物，在包含纹状体，扁桃体，海马结构或前皮层的四个不同冠状切片中进行记录。
4. 在室温下用碳源饱和至少1小时的高葡萄糖aCSF预孵育切片进行恢复。
5. 在孵育时间内，用移液管电阻拉伸移液器，介于4和8MΩ（尖端直径〜1μm）之间。
6. 在荧光显微镜的阶段将一个切片转移到记录室（浸没，500μl体积），并用竖琴固定切片。应使用标准的aCSF（125mM NaCl，2.5mM KCl，25mM NaHCO 3，1.25mM NaH 2 PO 3）连续灌注记录室（1.5ml/min）亚> 4，2mM CaCl 2，1mM MgCl 2和25mM葡萄糖;参见食谱部分），并保持在31-33 °C。
7. 谷氨酸能反应通过阻断多巴胺，GABA和乙酰胆碱的作用，加入到灌注液中的拮抗剂混合物分离：10μMSR95531,3μMCGP55345,10μMSCH23390,10μM（ - ） - 舒必利和1μM东莨菪碱。
8. 使用10x目标来关注感兴趣的区域，然后使用60x和相机来识别要修补的单元格。所有记录应在具有可见ChR2-EYFP轴突的区域进行。
9. 使用钠通道阻滞剂（QX-314）在细胞内溶液中以-75 mV保持电位进行电压钳记录，以阻止有效电流。可以在细胞附着模式下监测细胞活性。一旦实现了全细胞模式，由于铯基移液管溶液（包括QX-314）阻止了内在活性，因此只能根据细胞体的位置，大小和形状鉴定神经元。
10. 在定位健康的细胞后，使用非金属注射器针头用过滤的（0.2μm孔注射器过滤器）铯 - 葡萄糖酸铯细胞内溶液回填补片移液管，并将移液管安装在显微操纵器上的移液管支架中。将移液管吸头浸入浴液前，向玻璃移液管施加温和的正压;这可以防止由于溶液吸液和移液管堵塞而使细胞内溶液稀释
11. 使用显微操纵器将移液器推入所选择的细胞。用移液管尖端接触细胞膜后，轻轻推进以使膜变暗。释放正压并确认尖端电阻增加，然后对移液管施加温和的负压，施加负电位以达到GΩ密封，等待1-2分钟使密封最大化。施加进一步的负压使得移液管末端的膜破裂以进行全细胞记录，在穿透后迅速释放移液管的负压。
12. 为了最小化基线噪声以更好地检测小振幅兴奋性突触后电流（EPSCs），串联电阻不被补偿（见注释）。
13. 使用Axograph X或pClamp的数据采集在达到全细胞模式后5分钟开始，以允许细胞内溶液扩散到记录的细胞中。
14. 以每10秒（0.1Hz）的大功率蓝色LED照明的短暂闪烁（0.1Hz的5毫秒）进行光刺激以引起突触反应。为了监控串联电阻，在每次光刺激前50毫秒，施加5 mV，5毫秒的电压脉冲。每个单元记录至少20个响应。
15. 戊巴比妥反应应通过灌注40μMCNQX进行确证，药物应用后至少5分钟即可全面应用。

数据分析

对于每个细胞，平均10个连续痕迹。丢弃第一条迹线，因为由于突触连接的休息状态，EPSC幅度总是显着更大。
测量50毫秒后光刺激时间窗口内的峰值幅度。
用于确定连接的检测阈值应设置为在光刺激之前的100毫秒时间窗口中的基线（包括自发的EPSCs）振幅的平均值±2个标准偏差。当后刺激EPSCs的峰值振幅超过该阈值时，细胞计数为具有多巴胺神经元谷氨酸能连接（见图5）。

图5.确定多巴胺神经元谷氨酸能连接的强度和发生率。 A-C。痕迹显示无连接记录的细胞（锥体细胞1）和具有不同强度连接的两个细胞（锥体细胞2和3;蓝色痕迹）的实例。 AMPA /红藻氨酸受体拮抗剂CNQX（40μM）完全阻断显示谷氨酸调节的光刺激EPSC（锥体细胞3;红色痕迹）。灰色痕迹用于计算基线的平均幅度加上2个标准偏差（SD）;超过此阈值的响应被认为显示连接。 D.右下图，是该图所示数据的图。连接的强度被计算为具有连接的两个小区中的响应的平均幅度，而连接的发生率是显示与所记录的所有细胞的连接的小区的百分比，在这种情况下为2的3细胞。记录显示来自内嗅皮层。光刺激由蓝色条表示。

笔记

洗浴液和移液管可产生约15 mV的液体电位。要在线校正结电位并确定-75 mV的保持，将放大器的保持命令设置为-60 mV（Neher，1992）。
由于串联电阻补偿使用正反馈电路，在线补偿会增加基线噪声。一般来说，如果响应小，慢，则串联电阻补偿不会影响响应的幅度或时间过程，这是我们确认的。然而，串联电阻补偿应考虑在线或离线记录更大更快的响应（使用分析软件）。
为了改善突触后细胞的鉴定，可以用GFP遗传靶向记录的细胞，或者用可固定的标记（例如，biocytin，Alexa荧光染料）填充记录细胞，然后固定用已知细胞标记物双重标记细胞的组织。

食谱

10x aCSF无葡萄糖，镁或钙的储备溶液
43.83克NaCl
1.86克KCl
21.84g NaHCO 3
1.5g NaH 2 PO 4
加入ddH ₂ O以制成1升溶液并将其储存在4°C
高糖aCSF（1升）
在切片记录实验的当天使高糖aCSF
稀释10倍储备溶液10次（100ml 900ml ddH 2 O中的储备溶液）
加入18.02 g葡萄糖加入2ml 1M MgCl 2水溶液（加入95.21mg/1ml ddH 2 O）
加入0.7ml 1M CaCl 2溶液（加入147mg/1ml ddH 2 O）
标准aCSF（1 L）
在切片记录实验的当天使标准aCSF
稀释储备溶液10次（100ml储存液在900ml ddH 2 O中）
加入4.5 g葡萄糖加入1ml 1M MgCl 2溶液（加入95.21mg/1ml ddH 2 O）
加入2ml 1M CaCl 2溶液（加入147mg/1ml ddH 2 O）
如果加入CaCl 2，会导致碳酸钙沉淀，使碳水溶液饱和以清除沉淀物。
细胞内溶液（含有QX-314的葡萄糖酸铯，25ml），渗透压287mOsm
1ml 3.25M葡萄糖酸（Sigma-Aldrich溶液的摩尔浓度）
3.25ml 1M CsOH溶液（每1ml ddH 2 O加入130mg）
加入50μl1M MgCl 2溶液（加入95.21mg/1ml ddH 2 O）
2.5μl1M CaCl 2溶液（每1ml ddH 2 O加入147mg）
2.5ml 50mM QX-314溶液（加入17.2mg/1ml ddH 2 O）
250μl1M HEPES溶液（加入238.30mg/1ml ddH 2 O）
9.5毫克EGTA
加入17.948毫升ddH 2 O -/- 让溶液在4℃下静置过夜以稳定pH值
使用CsOH溶液将pH调节至7.3 加入25.4mg的ATP-Na 2
加入3.9mg GTP-Na 2
用2μm过滤器过滤溶液
制成1毫升等分试样，并将其储存在-20°C

致谢

该方案用于获得"神经科学杂志"（Mingote，S.，Chuhma，N.，Kusnoor，S.V.，Field，B.，Deutch，A.Y.and Rayport，S。[2015]）中公布的数据。前脑区多巴胺神经元谷氨酸能连接的功能连接分析。 J Neurosci 35 [49]：16259-16271）。根据哥伦比亚大学和纽约州精神病学研究所机构动物护理和使用委员会批准的方案，按照国家实验动物护理和使用指南健康指南的指导方针进行小鼠手术。这项工作得到了NARSAD青年研究者奖（SM），DA017978和MH087758（SR）的支持。

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