材料和试剂

W303a细胞系
乙酸钠三水合物（CH 3 CO 2 Na 3·3H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：236500）
苯酚（C 6 H 5 OH）（Sigma-Aldrich，目录号：P1037）
EDTA（Na 2 EDTA; 2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：ED2SS）
乙酸（CH 3 COOH）（Sigma-Aldrich，目录号：320099）
氯仿（CHCl 3）（Sigma-Aldrich，目录号：472476）
（C 9 H 7 NO）（Sigma-Aldrich，目录号：252565）。
NaCl（Thermo Fisher Scientific，目录号：S641-500）
合成完全（SC）培养基
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
异戊醇（Sigma-Aldrich，目录号：W205710）
乙醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：64-17-5）
DEPC水
苯酚AE缓冲液（参见配方）
苯酚：CHCl 3/AE-Na（参见配方）
CHCl 3：异戊醇（24:1）（参见配方）

设备

标准台式离心机
Microfuge
振动器
1.5 eppendorf管
液氮

程序

根据配方制备试剂。注意，一切都在DEPC水中。
在2ml SC培养基中接种表达不同TOR1-RR变体的W303a细胞过夜
在10ml SC培养基中从OD 600 = 0.1开始继代培养细胞，在30℃，300rpm下剧烈摇动约4-6小时，直到OD 600 = 0.4- 0.5。
通过旋转收集细胞而不在冰上冷冻。弃去上清液。
用1ml水重新悬浮细胞并转移到1.5微升管中，迅速离心3 000×g，15秒。
在室温下将细胞沉淀重悬在400μlAE缓冲液中
加入40μL10％SDS（最终约1％），并在室温（RT）下短暂涡旋
立即加入500μl热酚/AE（在使用前在65℃下放置10分钟），剧烈涡旋1分钟。
在65℃孵育5分钟。简短涡旋每30秒。
立即通过倾倒到液氮中冷冻（标签不会脱落）。
等待在室温下解冻（放在30°C解冻可能会破裂管）
在标准实验室微量离心机上，在RT下以20,000×g离心10分钟
转移约400μl上清至新的eppendorf管。按照您实验室中的化学安全方案，仔细回收低级苯酚馏分。
加入等体积（400μl）苯酚：CHCl 3/AE-Na。在室温下剧烈涡旋1分钟
在标准实验室微量离心机中旋转5分钟，在20,000英尺×g
转移上清液（约350微升）到新鲜的1.5毫升eppendorf管
加入CHCl 3：异戊醇（24:1）。在室温下剧烈涡旋1分钟
将含水上清液转移至新鲜的1.5ml微量离心管中。如果在水相和有机相之间观察到白色浑浊的沉淀，重复步骤17-18
加入1/10体积的3M NaOAc（pH 5）并剧烈涡旋。加入2.5倍体积的乙醇。再次涡旋。
置于-20°C至少30分钟。
在微型离心机中以20,000×10 6细胞/分钟在4℃下旋转15分钟。 RNA沉淀通常是可见的
加入冰冷的75％EtOH，置于4℃约10分钟。在4℃下涡旋并旋转离心20,000小时，15分钟。
弃去上清液。吸出管中的液滴。
白色RNA颗粒在干燥时会变得清澈。在澄清后立即加入30-50μlddH 2 O（DEPC）。
不要让RNA过干，这将使其难以溶解。如果RNA沉淀过度干燥，溶解RNA在37℃下30分钟。
将RNA储存于-80℃超过2个月。

食谱

苯酚AE缓冲液
制作乙酸盐-EDTA（AE）缓冲液
50mM NaOAc
10mM EDTA（pH5.0）用等体积的AE缓冲液平衡的液化苯酚。储存于4°C。
苯酚：CHCl 3/AE-Na
生成AE-Na缓冲区
10mM NaOAc
2mM EDTA 100mM NaCl（pH 6.0）
50％苯酚/AE
50％CHCl 3
0.25％8-羟基喹啉
储存于4°C。
CHCl 3：异戊醇（24:1）

致谢

该方案从Wei和Zheng（2009）和Wei等人（2009）改编并使用。

参考文献

Wei，Y。和Zheng，X.F。（2009）。 Sch9 部分介导TORC1信号传导以控制核糖体RNA合成。 Cell Cycle 8（24）：4085-4090。
Wei，Y.，Tsang，C.K.and Zheng，X.F。（2009）。 TORC1调节RNA聚合酶III依赖性转录的机制 EMEM J 28（15）：2220-2230。