材料和试剂

注意：在DPI机器上运行之前，所有解决方案都必须脱气。

脂质体制备
1. 圆形玻璃小瓶，例如直径20毫米，长125毫米的金瓶培养管，带螺帽（Kimble，目录号：73770-20125）
2. 石蜡膜
3. 聚碳酸酯膜;直径19mm，孔径100nm（Sigma-Aldrich，目录号：Z377419）
4. 注射器（运行缓冲液为50ml，样品加载3 ml）
5. 宽规格针
6. 脂质
7. 氯仿（VWR，目录号：22707.320）
8. 甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：494291）
9. MilliQ水
10. N 2气体
11. MOPS（3-吗啉代丙烷-1-磺酸）缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：M1254）
12. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：793566）
双极化干涉仪
1. 10％Hellamanex II（Hellma，Müllhein，Germany）
2. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：74255）
3. 100％乙醇
4. 氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：746495）（参见食谱）
5. 膜相互作用蛋白（例如NaD1）
6. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：EDS）（参见食谱）
7. 牛血清白蛋白（BSA），级分V，不含脂肪酸（Sigma-Aldrich，目录号：10775835001）
8. MilliQ水
9. 氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S5881）
10. 批量缓冲（见配方）
11. 2％SDS（参见食谱）
12. 80％乙醇（见食谱）

设备

脂质体生产
1. 水浴
2. 通风柜
3. 真空泵和腔室
4. 超声波浴
5. 震动孵化器
6. Avestin脂质体挤出机（Sigma-Aldrich，目录号：目录号：Z373400）
双极化干涉仪
1. 硅油氧氮化物芯片未修改（Farfield集团有限公司）
2. 垫片双通道（Farfield集团有限公司）
3. light ^® Bio200 DPI仪器（Farfield Group Ltd，UK）
4. 哈佛仪器PHD2000可编程注射泵

软件

Analight Explorer软件

程序

DPI脂质体的制备
1. 如Lee等人（2010）所述，为DPI制备脂质体。这包括将干燥的磷脂在氯仿中溶解到2mM原液，对于PI（4,5）P 2，在氯仿，甲醇和MilliQ水（20:9:1）中制备2mM原液）。 Avanti极性脂质提供有关将其脂质溶解在其产品单和网站上的要求的信息。
2. POPC：POPS：POPE：PI和POPC：POPS：POPE：PI（4,5）P 2/3的比例为56:10:30:4的脂质混合物是通过将将期望的2mM脂质储备至玻璃小瓶至终体积为410μl。
3. 然后将脂质在通风橱中的温水浴（≈55℃）中在氮气流下干燥。期望涂覆圆底管的底部和侧面的薄脂质膜。这是通过在氮气流下不断转动温浴中的倾斜小瓶来产生的。气体处于仅引起脂质混合物表面破裂的流速。一旦所有的可见液体蒸发，氮气流就会增加，并给出最终的吹扫管以除去剩余的有机溶剂。
4. 将脂质膜真空干燥过夜以确保完全除去液体。在此阶段之后，将瓶子盖上并用Parafilm密封，然后在-20℃下储存，直到需要。
5. 在40℃（720μl）下，将脱脂，新鲜制备的10mM MOPS，pH7中的脂质用150mM NaCl重新悬浮至1.14mM（平均脂质浓度）。通过在40℃的振荡培养箱中孵育30分钟，将脂质再水合。该温育的温度应高于凝胶 - 液晶转变温度（Tc或Tm），使脂质在其流体相中再水合。 Avanti极性脂质提供有关其脂质的Tc/Tm的信息。
6. 然后将水合脂质体混合物在温水浴（≈40℃）中超声处理20分钟，或直至澄清。超声波探头优选超声波探头，因为探针很可能使脂质样品过热。超声波探头也可以产生需要在使用脂质体之前离心除去的钛片段
7. 通过使用预热的Avenstin脂肪挤出机挤出混合物通过100μm聚碳酸酯膜21次，将脂质体制成均匀的尺寸。加热组装的挤出机有助于确保脂质混合物保持高于脂质的Tc。低于Tc的挤出脂质混合物通常会导致膜被刚性脂质体阻塞。将脂质体加载到挤出机中使用宽针头。在连接到挤出机组件之前，从注射器中取出所有空气。一旦准备好脂质体，就应该立即使用DPI。
双极化干涉仪
1. 如Lee等人（2010）所述进行双极化干涉测量（DPI）。使用 light ^® Bio200 DPI仪器进行测量。流量由外部的哈佛设备PHD2000可编程注射泵控制，它们采用脱气双蒸水灌注。如果使用此设置，则必须在泵上更改流量，并在控制DPI机器的"计算机注入"程序中设置。
2. 高度清洁的芯片表面是形成具有可重复结构的脂质双层的关键步骤。洗涤程序在芯片装入机器后执行，因此线路同时被清洁。使用三步洗涤程序清洁硅氧烷氮化铝，其包括以25μl/min注入8分钟的10％Hellamanex II的初始洗涤。以50μl/min注入4分钟，然后以50μl/min第三次洗涤100％乙醇4分钟，再次洗涤2％SDS。在所有三个洗涤步骤之间进行以50μl/min冲洗2分钟的水。
3. 清理芯片后，在设定的通道窗口中设置每个通道的干涉条纹。要校准芯片上的通道，按下具有三条平行垂直线的按钮，并拍摄高分辨率图像以观察芯片的质量。三个通道中的每一个应具有不同的波段和对应于波谷和光峰的相对均匀的图案（图1）。如果芯片质量好，数据采集按开始按钮开始。
  
  图1.芯片的质量可以通过三芯片通道的干涉条纹进行观察。 A。高质量的芯片表面在三个通道中的每一个中将具有代表光的谷和峰的不同的带。 B.随着芯片质量的恶化，这些频段将变得不那么明显和不均匀。
4. 通过以50μl/min注入120μl80％乙醇，然后将100％80％乙醇的线性梯度注入到本体缓冲液（10mM MOPS缓冲液，pH7，用150mM NaCl）中来实现芯片的校准，以20μl/min（图2）。然后进行140μl水注入，以50μl/min进行批量校准。缓冲区基线在整个校准步骤中应保持稳定，只有在温度变化时才能改变
  
  图2. NaD1（4μM）与双层结合的TM和TE相变曲线。配置文件的第一部分包含由初始80％乙醇注射组成的芯片校准数据，其次是线性注射100％至0％的80％乙醇，然后批量校准140μl注射液。在温度从20℃升至28℃时，型材基线会降低。一旦通过注射脂质体（POPC：POPS：POPE：PI [4,5] P _{2），然后进行钙注射，基线稳定化后，形成脂质双层。然后由于温度降低回到20°C，基线会增加。接下来，将蛋白质（NaD1,4μM）注射4分钟，然后分离30分钟。通过使用10％Hellamanex II，2％SDS和100％乙醇的两次洗涤的三步洗涤程序除去脂质双层，将芯片表面再生以供将来使用。}
5. 允许芯片读数在20℃和28℃下在大容量缓冲器中稳定。一旦基线在28℃稳定，在20微升/分钟的2mM CaCl 2存在下注射脂质体（0.1-0.2mM）10分钟，随后注射2mM CaCl在10mM MOPS缓冲液pH7中，用150mM NaCl（200μl）（图2）洗脱2次。钙的存在有助于支持的脂质双层的形成和稳定。根据脂质组成，钙的浓度可能需要在1-5mM的范围内变化。具有高PE和其他带负电荷的脂质的脂质体将需要更大量的钙以形成稳定的双层。如果需要进行蛋白质相互作用研究，可以通过在运行缓冲液中注入2mM EDTA来从脂质双层表面除去钙离子。
6. 吸附的脂质双层在运行缓冲液中进一步平衡另外20分钟，直到达到稳定的基线。这是在28°C和20°C下进行的。每个温度的基线稳定约需20分钟。
7. 可以用50μlBSA（50μg/ml的运行缓冲液）注射支持的脂质双层中的缺陷的覆盖和存在。通过不存在BSA结合来确认脂质双层的完全覆盖。
8. 制备目标蛋白NaD1用于在运行缓冲液中注射。将具有16,8,4,2或1μMNaD1的样品（160μl）在40μl/min注射4分钟之前脱气，然后在运行缓冲液中解离30分钟（图2）。
9. 芯片表面被再生和清洁，并为每个NaD1注入沉积新的双层。所有溶液在注射前都脱气

数据分析

使用Analight Explorer进行数据处理
1. 在Analight Explorer软件中打开数据文件。
2. 首先，通过在"显示窗口"中单击"解析器配置"来处理校准数据。要处理校准数据，需要定义所显示的轮廓的校准（芯片校准，线性化，20°C的体积和28°C的体积）的各个方面。这些校准方面通过将蓝轴置于校准的每个部分的开始和结束（图3）来定义。
  
  图3.使用Analight Explorer软件处理DPI校准数据。在20°C和28°C下对4项校准，芯片校准，线性化，体积分数进行分析，由首先在轮廓上定义校准数据的开始和结束。对于芯片校准，这涉及将第一个蓝色轴位于水峰（A）顶点的80％乙醇峰和末端蓝色轴的顶点。通过将起始蓝轴设置在80％乙醇-H 2 O梯度的开始边缘处，通过线性化数据校正周期性误差，并且在80％乙醇 - H 2 O梯度（B）。在20℃下通过将起始蓝色轴置于H 2 O 2凹陷的顶点并且在20℃（C）处将本体的末端蓝色轴放置在体积缓冲液中而获得20℃的体积校准，在28℃下，通过在脂质体注射之前以稳定的基线将起始蓝色轴置于H 2 O 2的顶点处，并且末端蓝色轴在28℃下以稳定的基线进行校准）。
3. 通过使用与图2中校准数据分析相同的方法点击Resolver离散数据来处理脂质和肽层的值。也就是说，蓝色轴置于脂质体注射前的缓冲液基线该轮廓表示裸芯片，第二个蓝色轴位于在20℃下肽注入之前表示脂质层的轮廓上的点。
4. 最后，在刚刚在20℃的肽 - 脂质层再生之前蛋白质解离结束时，最后一个蓝色轴被放置在轮廓上。可以在"分析"窗口中处理和显示图层属性。在这个窗口中，需要定义轮廓的每个部分的各个材料。也就是说，选择80％乙醇和H 2 O 2作为芯片校准材料，并且在20℃和28℃下对于两种散装材料选择H 2 O 2。在离散数据部分中，为RII（折射率增量）选择脂质，对于裸芯片选择体28，并且为脂质和肽层选择体20。所有实时值都可以通过点击"计算全部"来计算。从这些实时值可以计算双折射值。这是通过选择RI（或厚度值）作为固定值，然后单击"计算全部"按钮来执行的。
计算各向异性层的光学双折射和质量
1. 脂质分子自组装成单轴对准的双层膜，产生具有两个主折射率的单轴光轴的各向异性系统，即非均匀折射率（），其表示平行于光轴和表示垂直于光轴偏振的电矢量的普通折射率（ no ）。脂质膜的这两种折射率和和之间的差异被定义为双折射：
  
  （Den Engelsen，1976; Ramsden，1999; Salamon and Tollin，2001）。
  通过计算两个有效折射率之间的差异，即TM波导模式的RI（TE波导模式）和TE波导模式的RI，从DPI获得双折射（ n _TE）。双折射值表示脂质分子的取向度和密度的平均测量，并且对这些参数的小变化高度敏感。通过将沉积层的RI固定为1.47来确定有效双折射（ TE ），其指示通过在运行缓冲液中以1mg/ml不存在牛血清白蛋白结合来确定均匀的层覆盖度。
  de Feijter公式（De Feijter et al。，1978）用于从DPI测量中计算吸附的脂质和肽层的质量。脂质双层的质量（ m _lipid）和肽（）使用：
  计算与芯片的绑定
  哪里，
  d _f是双层的厚度，
  _iso 是附着的双层平均各向同性RI，
  _缓冲区是MOPS缓冲区的RI，
  是附着的双层的特定RI增量。
  De Feijter公式假设整个实验中保持不变。为了进行分析，将用于脂质的标准值为0.135和0.182ml/g和肽。测量MOPS缓冲液（ n 缓冲液）的折射率为1.3349（T = 20℃）。改变缓冲液的盐浓度将直接影响RI值，例如增加的盐浓度将导致增加的RI值。对于POPC：POPS：POPE：PI（n = 10），平均双层厚度为46.1，十次实验的标准偏差为0.4Å，双折射为0.0198±0.0005，平均双层厚度为48.6±0.5，在不存在肽的情况下，POPC：POPS：POPE：PI（4,5）P 2膜（n = 10）获得了0.0191±0.0003的双折射。从Payne等人可以看到从该方法获得的数据。（2016）。

笔记

图形数据：DPI生成数千个数据点，涉及这些数据点的初始计算可以在Microsoft Excel类型程序中完成。然而，由于需要绘制大量的数据点，Graphpad Prism或Sigma plot对于绘制整个数据集更为有效。

食谱

大量缓冲液（10mM MOPS缓冲液pH7，含150mM NaCl） 10 ml 0.1 M MOPS
90ml脱气MilliQ
88μl5 N NaOH
876.6mg NaCl
溶解盐，然后脱气缓冲液
2％SDS
将4g SDS溶于200ml MilliQ中并脱气
80％乙醇
将160ml 100％乙醇加入到40ml MilliQ中并脱气
CaCl 2
在大量缓冲液中制备2mM CaCl 2，并脱气
EDTA
在大量缓冲液中制备2mM EDTA并脱气
BSA
BSA以50μg/ml的体积缓冲液溶解，然后脱气

致谢

MAA由澳大利亚研究委员会资助（DP150104386）。 MIA承认国家卫生与健康局的支持。医学研究委员会（＃1044327）和澳大利亚研究委员会（DP1110101866）。方案根据Lee等人（2010）和Payne等人（2016）的工作进行了改编。

参考文献

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