材料和试剂

1.7ml Advant微管（MIDSCI，目录号：AVSS1700）
铝箔
0.22μm过滤器（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：09-720-004）
显微镜盖玻璃（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12-545A）
显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12-550-A3）
BP830，a。变体ATCC 29413衍生物，其含有pcnfR1：lacZ 融合物（Pratte和Thiel，2016）
氯化铵（NH 4 Cl）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：A661-500）
TES缓冲器（AG Scientific，目录号：T-1050）
DMSO（二甲基亚砜）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP231-1）
Millipore水
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：M63-500）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP510-500）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：S271-1）
无水磷酸氢钾（K 2/2 HPO 4）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：P288-500）
四氯化锰（MnCl 2·4H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：M87-100）
钼酸钠二水合物（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1003）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：Z76-500）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP346-500）
硼酸（H 3 3 BO 3）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP168-500）
六氯化钴（CoCl 2·6H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：C371-100）
氢氧化钾（KOH）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：P250-500）
乙二胺四乙酸（Na 2 EDTA·2H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP120-1）
硫酸亚铁七水合物（FeSO 4·7H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：I146-500）
25％戊二醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G5882）
基因表达试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：I2904）
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对苯二胺（Sigma-Aldrich，目录号：P-6001）
甘油（Thermo Fisher Scientific，目录号：G33-1）
碳酸氢钠（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP328-500）
Allen和Arnon（AA）培养基（Allen和Arnon，1955）：（AA/8 = AA的8倍稀释度）（参见食谱）

AA/8媒体
AA磷酸盐储备溶液
K 2> HPO 4 储备溶液
微量元素库存解决方案
AA FeEDTA解决方案

0.04％戊二醛溶液（参见食谱）
在25％DMSO中的100μM5-十二酰胺荧光素二-β-d吡喃半乳糖苷（C12-FDG）（参见食谱）
0.5 M碳酸盐缓冲液（见配方）
防腐解决方案（见配方）

设备

125毫升玻璃烧瓶（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10-040D）
用于125ml烧瓶的塞子（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：1412740C）
振荡器（设定在170rpm）（Eppendorf，New Brunswick ^TM，型号：Innova ^® 2100）
离心机（Eppendorf，型号：5415D）*
孵化器（水浴）（37°C）（Polyscience，型号：2LS-M）*
环境室设置在30°C，70％湿度和浅色
分光光度计（Bibby Scientific，JENWAY，型号：7300）
Zeiss Confocal LSM700使用Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27物镜（Carl Zeiss，型号：LSM700）

注意：这些产品已经停产。

程序

文化成长
1. 从琼脂平板上的菌落开始，接种A株菌株。变种或鱼腥藻含有含有5mM NH 4 Cl和10mM TES，pH 7.2的AA/8中的含有lacZ融合体（Pratte和Thiel，2016所述构建）的PCC 7120和抗生素，必要时。在30°C，以100-120μE/m 2的光照下以170rpm振荡培养物，并允许生长约10代（3-4天）。
2. 氮降解前两天，在含有5mM NH 4 Cl和10mM TES（pH7.2）的AA/8中稀释培养物1：100，并允许它们在30℃下摇动继续生长，光到OD 为0.1-0.2。蓝细菌应积极生长数代，以便在去除固定氮后能很好地分离异养细胞。生长条件的一致性提高了培养物中β-半乳糖苷酶生产的重现性
3. 在AA/8中洗涤积极生长（步骤A2）3×的蓝藻培养物以除去氮。将培养物重悬于720nm的OD < 0.1在含有（+ N）或不含（-N）5mM NH 4 Cl和50mM TES，pH 7.2的50ml AA/8的125ml烧瓶中，并用光和生长24小时，摇动在开始原位定位测定之前检查杂种的培养物。
原位本地化
1. 在微量离心机中以16,000 x g的速度将2-5ml培养物在1.7ml Eppendorf管中旋转5分钟。
2. 用500μl水洗涤细胞两次以除去生长培养基
3. 将细胞在25℃下在500μl0.04％戊二醛中固定15分钟
4. 在微量离心机中以16,000 x g离心细胞1分钟，并除去戊二醛溶液。
5. 用500μl水洗涤沉淀两次以除去残留的戊二醛
6. 将沉淀重悬于30μl底物 - 100μM5-十二烷酰胺荧光素二-β-d吡喃半乳糖（C12-FDG）的25％DMSO中，并在37℃下暗处孵育30分钟。
7. 在微量离心机中以16,000 x g离心细胞1分钟，并除去底物
8. 用500μl水洗涤沉淀两次以除去残留的底物注意：这一步对于实现低背景荧光很重要。
9. 将沉淀物重悬于20μl抗真菌液中以保持荧光稳定。将细胞保持在黑暗中，直到显微镜观察。立即进行成像。
10. 添加〜2μl准备的细胞到具有盖滑动的显微镜载玻片上并且使用计划的Apochromat 63x/1.4油DIC M27目标在Zeiss Confocal LSM700上显现。使用激发（488nm）和发射（400-557nm）波长（来自氩离子激光）来特异性检测荧光素荧光的细胞中的lacZ 的表达，而蓝细菌自发荧光用激发（ 561nm）和发射（565-700nm）波长以检测蓝藻藻胆蛋白荧光。通常我们观察数百根长丝，然后选择具有足够代表性丝线的场用于成像。

数据分析

使用具有平面Apochromat 63x/1.4油DIC M27物镜的明视野显微镜在样品中鉴定了在盖玻片下的玻璃显微镜载玻片上的长平面蓝细菌细丝。在30周期，时间序列采集期间，使用透射光通道获得亮场图像。通过使用来自氩离子激光的561nm照射的激发获得相同细丝的藻胆蛋白自发荧光的图像，并使用30周期时间序列采集在565-700nm的可视化。增益设置为600，并且稍微调整焦点，以在活体连续快速扫描期间优化从细胞发出的藻胆蛋白自发荧光。通常，营养细胞比异囊细胞显示更高水平的藻胆蛋白自身荧光。使用来自氩激光器的488nm照射激发荧光素，测量lacZ 表达，并使用30周期时间序列采集在400-557nm显现。检测荧光素的增益通常设定在800，但可以调整以检测较低水平的荧光。发射较低荧光水平的细胞需要更高的增益来显现荧光，而较低的增益可以看到更高的荧光水平。图像被保存，然后转换成TIFF文件，以便最终分析实验对照菌株中的lacZ（荧光素）的水平和细胞类型特异性表达。典型图像的例子如图1所示

图1. 原位 本地化 lacZ 表达式 A。含有cnfR1：lacZ 报告者（BP830）（Pratte和Thiel，2016）的变应性氮耗竭（-N）或固定氮（+ N）。箭头表示代表性的异型囊。左图：光照片;中间板：蓝藻中光合色素的红色荧光;右图：β-半乳糖苷酶切割5-十二酰基荧光素-β-D-半乳糖吡喃糖苷的荧光素荧光。

笔记

用C12-FDG彻底洗涤细胞以除去尽可能多的底物，因为它可以导致高背景荧光。
使用C12-FDG处理细胞后，保护细胞，包括当它们在显微镜载玻片上时。
使用防褪色溶液来防止荧光素被激发光漂白。
如果C12-FDG在细胞中不能正常工作，请尝试未修饰的FDG或其他FDG衍生物：5-五氟苯甲酰氨基荧光素，C8-FDG或5-氯甲基荧光素（ http://www.mobitec.de/probes/docs/sections/1002.pdf ）。
如果您喜欢红色荧光，您可以尝试使用resorufin或C8-resorufin标记的β-D-吡喃半乳糖苷（ http://www.mobitec.de/probes/docs/sections/1002.pdf ）。

食谱

Allen和Arnon培养基（AA）（稀释8倍[AA/8]）
注意：鱼腥藻以八倍稀释的Allen和Arnon培养基（Allen和Arnon，1955）生长。

AA/8媒体
3.1毫升AA-磷酸盐储备溶液
0.8ml K 2 HPO 4储备溶液
996.0毫升Millipore水
将等分试样在125毫升带有塞子和铝箔覆盖的烧瓶中，然后在121℃下高压灭菌30分钟。
AA磷酸盐储备溶液
500ml 4％MgSO 4·7H 2 O（终浓度1％）
500ml 1.2％CaCl 2·2H 2 O（终浓度0.3％）
500 ml 3.8％NaCl（最终浓度为0.95％）
500毫升微量元素储备溶液
K 2> HPO 4 储备溶液
28.0g K 2 HPO 4
500.0毫升Millipore水
微量元素库存解决方案
160.0 ml AA Fe-EDTA溶液
360mg MnCl 2·4H 2 O
35mg Na 2 MoO 4·2H 2 O 44.0mg ZnSO 4·7H 2 O
15.8mg CuSO 4·5H 2 O
572.0mg H 3 BO 3
8.0mg CoCl 2·6H 2 O
1,090.0毫升Millipore水
AA FeEDTA溶液

0.04％戊二醛溶液
40μl1％戊二醛溶液
960微升Millipore水
（1％戊二醛溶液：40μl[25％戊二醛溶液]）加入960μl[Millipore水]）
在25％DMSO中的100μM5-十二烷酰胺荧光素二-β-d半乳糖吡喃糖苷（C12-FDG）
5μl20mM C12-FDG（以ImaGene Green提供）基因表达试剂盒
250μl100％DMSO
745微升无菌微孔水
0.5M碳酸盐缓冲液pH 8.0
5.42 碳酸氢钠
9毫升Millipore水
将pH调至8.0，并用Millipore水将体积调至10ml
防风解决方案
将30毫克对苯二胺溶于4毫升无菌微孔水中加入6.0毫升甘油加入1.0 ml 0.5 M碳酸盐缓冲液（pH 8.0）过滤0.22μm过滤器以除去任何未溶解的化学物质，并在-80℃黑暗中储存在0.5ml等分试样中。

致谢

该方案基于经修饰用于蓝细菌的枯草芽孢杆菌（Bylund等人，1994）的早期方案。国家科学基金资助项目MCB-1052241提供了本次研究的支持。

参考文献

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